第4章基因工程的主要技術(shù)及其原理-資料下載頁
2025-02-18 14:17本頁面
【正文】 CTP) ? 一對引物 ? DNA聚合酶 (Taq酶） ? 無菌水（補足體系用） （一） TaqDNA聚合酶 ? 以單鏈 DNA為模板，以引物為起點，按 5’ ?3’方向合成新生互補鏈 ? 無 3’ ?5’外切酶活性 ? 耐高溫（ 95 ?C） ? 最適合成 DNA溫度為 72 ?C （二）引物 ? 引物長度 (1630bp) 退火 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 變性 5’ 3’ 3’ 5’ ? 防止一對引物內(nèi)及引物之間同源性，避免形成引物的發(fā)卡結(jié)構(gòu)或“二聚體” ? GC含量為 40%60%，兩引物的 Tm值相近， Tm = 2（ A+T） + 4（ G+C） ? 引物 3’端不能進行修飾或形成二級結(jié)構(gòu)； ? 引物的 5’端可進行修飾，如添加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛等 引入突變位點、插入或缺失突變序列等。 （三） PCR反應的最佳條件 ? Taq DNA聚合酶的濃度為 ； ? dNTP的濃度為 20200umol/L。 ? Mg2+濃度為 ； ? 引物濃度為 。 三 PCR技術(shù)的應用 （一） 反轉(zhuǎn)錄 PCR （二） 錨定 PCR （三） 反向 PCR （四） 巢式 PCR 設計一對外測引物和一對內(nèi)測引物 先用外測引物擴增含目的 DNA的大片段 再用內(nèi)測引物以擴增的大片段為模板擴增目的 DNA片段 模板 DNA 加外側(cè)引物 A和 B 引物 A 引物 B PCR 加內(nèi)側(cè)引物 C和 D 引物 C PCR 引物 D 巢式 PCR示意圖 （五） 實時定量 PCR 在普通 PCR 儀的基礎上再配備一個激發(fā)和檢測的裝置。通過 PCR反應的數(shù)學函數(shù)關(guān)系，加入標準品，可以對待測樣品中的目標基因進行準確定量。該法具有高特異性和可靠性，實驗結(jié)果穩(wěn)定，重復性好，在臨床檢測方面有廣泛的用途。 （ 1） TaqMan熒光探針 TaqMan熒光探針的標記原理 （ 2） SYBR熒光探針 DNA雙鏈非特異性內(nèi)嵌染料（ SYBR GreenⅠ ）能特異性地結(jié)合到雙鏈 DNA上，而不結(jié)合到單鏈 DNA上，并且結(jié)合后的染料的發(fā)光強度會明顯增加，沒有結(jié)合的染料在溶液中只能發(fā)出很微弱的熒光。 第五節(jié) DNA序列分析 一 MaxamGilbert化學降解法 二 Sanger雙脫氧鏈終止法 第六節(jié) 基因定點誘變 使已克隆基因或 DNA片段中的任何一個特定堿基發(fā)生取代、插入或缺失變化的過程叫作基因的定點誘變，是基因工程和蛋白質(zhì)工程的重要手段。 一 盒式誘變 二 寡核苷酸引物誘變 應用化學合成的含有突變堿基的寡核苷酸短片段做引物，進行 DNA復制，使寡核苷酸引物成為新合成的 DNA子鏈的一個部分。 三 PCR誘變 重組 PCR定點突變法示意圖 大引物誘變法示意圖 第七節(jié) DNA與蛋白質(zhì)互作分析 一 酵母雜交系統(tǒng) 酵母雜交系統(tǒng) 酵母單雜交：研究 DNA與蛋白質(zhì)的相互作用 酵母雙雜交：研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用 1. 酵母雙雜交系統(tǒng)的原理 酵母雙雜交系統(tǒng)的原理示意圖 酵母單雜交系統(tǒng)的原理示意圖 2. 酵母單雜交系統(tǒng)的原理 二 凝膠阻滯試驗 凝膠阻滯實驗的基本原理圖 放射性標記的 DNA由于同一種細胞蛋白質(zhì) B結(jié)合，于是在凝膠電泳中移動速度變慢，在放射自顯影中呈現(xiàn)滯后的條帶 A C B 放射自顯影 * * * * 凝膠電泳 放射性標記的 DNA 細胞蛋白質(zhì)提取物 蛋白質(zhì)與 DNA結(jié)合 * * * * * * B DNA蛋白質(zhì)結(jié)合物電泳遷移緩慢 滯后帶表明 DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合 三 DNaseI足跡試驗 DNaseI足跡試驗示意圖 三 DNA與蛋白質(zhì)互作的免疫沉淀分析 （一） 與蛋白質(zhì)特異結(jié)合的 DNA免疫沉淀分析 1). 提取目標生物的總 DNA，酶切，連上接頭； 2). 將連上接頭的 DNA與融合蛋白一起溫育； 3). 用融合蛋白上的標簽蛋白抗體與融合蛋白結(jié)合，用沉淀法分離復合物， 使其結(jié)合的 DNA被免疫共沉淀； 4). 用有機溶劑除蛋白，釋放 DNA （二） 染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù) 染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)原理示意圖
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