【正文】 濃度不
夠,所含質(zhì)粒數(shù)量較少,提取質(zhì)粒時操作猛烈,導(dǎo)致片段化等。由于第一次
照相的效果不好結(jié)果看得不太清楚。
pEThis酶切結(jié)果分析如圖2所示











左數(shù)第一條帶為pEThis質(zhì)粒2,3為pEThis質(zhì)粒酶切的大片段小樣。
小的片段已經(jīng)跑出凝膠了我們主要回收大的片段。由小圖
1


圖2

內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物系本科生基因工程實驗論文 樣清晰度來看酶切成功的含量應(yīng)該很大。由于未被酶切的質(zhì)粒呈現(xiàn)超螺
旋結(jié)構(gòu)故電泳時跑的位置靠下。而被酶切的片段呈現(xiàn)線性跑的速率相
對較慢故呈現(xiàn)上圖的情形。
pEThis酶切膠回收電泳檢驗,如圖3所示







圖中,2號孔代表未被酶切的質(zhì)粒,37號孔代表膠回收的產(chǎn)物
由于含量很低照相后無法很清楚的看到條帶在紫外燈下能夠看到條
帶但很微量不太清晰。
pMD19TBAP的構(gòu)建轉(zhuǎn)化檢測 pMD19TBAP的構(gòu)建轉(zhuǎn)化檢測。
用已經(jīng)擴增好的PCR 產(chǎn)物(BAP)與pMD19T PCR 載體直接連接。
并將連接好的pMD19TBAP質(zhì)粒導(dǎo)入DH5α感受態(tài)菌中進(jìn)行誘導(dǎo)鑒定。
將轉(zhuǎn)化的DH5α感受態(tài)菌搖菌培養(yǎng)后涂平板。涂到LB(Amp+)的固體培養(yǎng)
基中過夜培養(yǎng)進(jìn)行藍(lán)白斑鑒定。將每個平板挑取三個白菌落一個藍(lán)菌
落分別加入加了3mlLB(+Amp)的試管中標(biāo)記在超凈工作臺中工作。然后
培養(yǎng)3h
將培養(yǎng)的菌取出按照試劑盒提質(zhì)粒后進(jìn)行電泳鑒定。我組的電泳結(jié)果
過于模糊因而用的別組的照片進(jìn)行分析







圖
4

圖3



內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物系本科生基因工程實驗論文 1為pEThis質(zhì)粒23,4為藍(lán)菌落所提質(zhì)粒510為白菌落所提質(zhì)粒。
由圖可知5和7號樣的連接錯誤而6號樣出現(xiàn)兩個條帶可能是因為在
挑取菌落的時候挑了兩個以上的單菌落而真正成功連接的為10號樣。
失敗的原因可能是菌落太小在挑取時顏色分辨的不是很清楚感受態(tài)菌
體本身有問題PCR產(chǎn)物有問題T載體有問題平板涂布不均勻連接出
現(xiàn)問題等。
pMD19TBAP的酶切
借用別組的照片我們的在紫外燈下看得到微弱的條
帶可是在成像儀內(nèi)照相后看不到條帶















1為pEThis質(zhì)粒2為PCR產(chǎn)物36為酶切產(chǎn)物。
36中明顯可以看到2條條帶分別為大片段和小片段本次我們需要
回收的為大小和PCR產(chǎn)物相近的小片段。所以采用這些酶切結(jié)果進(jìn)行膠
回收。
pMD19TBAP膠回收的結(jié)果
圖6
1為PCR產(chǎn)物25為膠回收產(chǎn)物。 圖
5



內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物系本科生基因工程實驗論文 我組的產(chǎn)物位于第三泳道在紫外燈下能夠看到條帶可能是由于含量太少成
像儀照相的照片沒有條帶。
pEThisBAP的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化和檢測
圖7















由右到左依次為 1為pEThis質(zhì)粒其余皆為連接載體的提取物
由圖可知除了marker外7皆有亮度出現(xiàn)但由于有嚴(yán)重的拖
尾現(xiàn)象所以目前不能確定是否連接正確但為了后續(xù)試驗我組決定擴大培養(yǎng)
該五組菌體然后進(jìn)行蛋白質(zhì)檢驗。出現(xiàn)嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象可能是因為電泳槽的溫
度太高導(dǎo)致DNA 片段化進(jìn)而出現(xiàn)大范圍的拖尾現(xiàn)象但具體原因尚不明確。
SDSPAGE檢測pEThisBAP的表達(dá)
將正確的質(zhì)粒對應(yīng)的菌液上步對應(yīng)的7的菌液加入6ml的LB
葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)基30℃慢搖過夜,加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),本組做的為時間梯度,檢測
如圖8所示。
圖8


內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物系本科生基因工程實驗論文 分析
電泳泳道設(shè)計111泳道加樣順序依次為marker、堿性磷酸酶、IPTG空菌BL21
DE3、空載體BL21DE3。5a、5b、5c、6a、6b、6c、7c。電泳點樣時總共點樣11
電泳完成后電泳條帶沒有完全跑開,集中在整個膠的1/3處。Marker在右邊第一泳道
隱約可見但是其他泳道中也可以看到條帶的出現(xiàn)但是由于沒有跑開所以并不能
確定是否有蛋白的出現(xiàn)也無法確定該蛋白就是我們需要的蛋白。因此此次實驗可以說
是失敗的。
原因可能是在上一步挑選正確的菌群時有問題由于拖尾導(dǎo)致無法確認(rèn)錯把非正
確連接的菌體當(dāng)做正確的凝膠配制有問題指示劑已經(jīng)跑出了膠版但是條帶卻還沒
有跑下來電泳儀的問題由于電壓不穩(wěn)電流一直沒有達(dá)到需要的值膠版不夠干凈
可以明顯看到一些小顆粒的存在可能會影響實驗結(jié)果等。 4 討論 本次實驗過程進(jìn)行的還算順利我們也得到了一定的產(chǎn)物。但就是所得到的電泳圖
效果不太好沒辦法從圖上直觀的看到我們的實驗結(jié)果這是比較遺憾的一點。在具體
操作時由于人員的眾多導(dǎo)致實驗的操作等不太均一。我們對實驗過程缺乏一些深入
的理解再加上實驗室的儀器也有些不準(zhǔn)確如移液器在移取微量的實試劑時存在較
大的誤差也使得我們的實驗結(jié)果沒有達(dá)到預(yù)想的結(jié)果。 參考文獻(xiàn) [1] 邢萬金基因工程實驗指導(dǎo)內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物基因工程研究室

[2] 王秋穎. 堿性磷酸酶特性及其應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].中國畜牧獸醫(yī), 2011, 38(1).
[3] 肖 美 燕,徐 爾 菌 堿 性 磷 酸 酶 的 提 取 研 究[J]. 食 品 工 業(yè)
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[4] 余榕捷,汪炬,謝秋玲,
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達(dá)[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2012,39(4):1
[6] 李瑩,陳斌,敬俊鋒,
[J]. 重慶師范大學(xué)學(xué)報自然科學(xué)版.2012,29(1):7882
[7] 張立全,劉慧, BL
21(DE3)中的表達(dá)[J]. 內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2005,5(36):284287

內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物系本科生基因工程實驗論文 致謝 感謝內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的基因工程實驗室提供先進(jìn)的實驗平臺感謝王鄭老
師以及師姐們的認(rèn)真指導(dǎo)和熱心的幫助感謝我的同組成員范曉婷的幫助和配合我們
度過了很愉快的一周時間。 感想 本次大實驗我明白今后做實驗時應(yīng)該小心謹(jǐn)慎熟悉每一個操作步驟了解每一
個儀器的使用方法熟知每一個試劑的特殊之處明白作用機理在實際操作中主動
詢問對于不懂得地方主動研究。吸取失敗經(jīng)驗努力做好下一次實驗。
我們分工合作雖然最終沒有得到表達(dá)產(chǎn)物但在實驗中學(xué)會了很多。實驗讓我們
體會到了細(xì)節(jié)的重要性實驗中的一些細(xì)節(jié)一定不能忽略我們最終的重大錯誤往往
是因為一個小小的細(xì)節(jié)而釀成的。還有就是不要輕易的丟棄實驗結(jié)果要進(jìn)行仔細(xì)的觀
察和分析找到問題所在為以后的實驗鋪平道路。
做一名生物工作者首先要熱愛這份工作。我們每天都在和儀器、試劑一起工作
可能會不斷地重復(fù)同樣的步驟但只要我們懷著那一份熱愛就不會感到無聊和枯燥
我們也能體會到生物工作的快樂