【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 μg/mL每個(gè)培養(yǎng)皿中約 20mL 倒制平板。 2. 方法
設(shè)計(jì)引物
PCR引物





BAP基因的PCR擴(kuò)增
由老師提供pMD19TBAP質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
在 PCR微量離心管中按下列劑量配制 50μL 的PCR反應(yīng)體系。 內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物系本科生基因工程實(shí)驗(yàn)論文








設(shè)置 PCR 儀的循環(huán)程序
① 94℃ 3min
② 94℃ 30s
③ 58℃ 30s
④ 72℃ 1min
⑤ 72℃ 10min
PCR結(jié)束后取9μl產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠泳。 觀察是否有預(yù)計(jì)分子量的主要產(chǎn)物帶。
注退火溫度: 58℃PCR3h。
DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)的制備
預(yù)冷10 min的無(wú)菌微量離心管做上相應(yīng)標(biāo)記。
BL21(DE3)菌液 DH5α菌液然后在
冰上放置 10min 5000r/min 4℃ 離心 10min棄上清。
加入 1ml 冰冷的 mol/L CaCl2溶液立即在渦旋混合器上混勻插入冰
中靜置 30min。
4℃5000r/min 離心 10min。棄上清液后用 1mL 冰冷的 mol/L CaCl2溶液重懸菌體插入冰中放置 30min。
4℃5000r/min 離心 10min。棄上清液后用 200uL 冰冷的 mol/L CaCl2溶液重懸菌體。
在超凈工作臺(tái)內(nèi)將兩種菌按50ul/放于4℃冰箱待用。
pMD19TBAP的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化和檢測(cè)
PCR 產(chǎn)物(BAP)與pMD19T PCR 載體直接連接
陽(yáng)性PCR產(chǎn)物與pMD19T載體PCR 連接。在離心管中加入 PCR
體系 50μL總 PCR Supermix
45μL
模板質(zhì)粒 1μL已稀釋50倍
Primer1
1μL
Primer2
1μL dd water
2μL
循環(huán)30次 內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物系本科生基因工程實(shí)驗(yàn)論文







在干式恒溫氣浴中16℃連接3 h。(實(shí)際操作時(shí)考慮到PCR產(chǎn)物濃度不高,故加了4μ
L, 沒(méi)有加水。)
感受態(tài)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化
將恒溫水浴的溫度調(diào)節(jié)到 42℃。
從4℃ 冰箱中取出感受態(tài)菌冰浴7min。
取10 uL連接好的質(zhì)粒與感受態(tài)細(xì)菌DH5a混勻在冰上放置20min。
于42℃水浴中90S進(jìn)行熱休克然后在冰中放置4 min在超凈臺(tái)上加
入300uL LB培養(yǎng)基不含氨芐青霉素37℃振蕩培養(yǎng)45 min。
超凈臺(tái)上取上述轉(zhuǎn)化的混合液150μL、
中加入40μL 20% xgal7μL 20% IPTG 混勻。
將上述菌液用涂布棒均勻的涂布在含Amp的LB固體培養(yǎng)基上37℃恒
溫培養(yǎng)過(guò)夜。
pMD19TBAP的鑒定提取質(zhì)粒使用tiangen試劑盒
觀察菌落生長(zhǎng)狀態(tài) LB
培養(yǎng)基中37℃搖菌培養(yǎng)8h。
分別取 的菌液于 離心管中12000r/min 離心1min棄
上清。
柱平衡向吸附柱CP3吸附柱加入收集管中加入500μl的平衡液
BL,12000rmp離心1分鐘倒掉收集管中的液體將吸附柱放回到收集管
中。
將留有菌體沉淀的離心管加250ul 溶液 P1懸浮細(xì)胞沉淀。
再向離心管中加250ul溶液 P2溫和上下翻轉(zhuǎn)68次。
向離心管中加350ul溶液 P3溫和上下翻轉(zhuǎn)68次充分混勻此時(shí)將出
現(xiàn)白色絮狀沉淀12000r/min離心10min。
吸取上步中離心上清液并轉(zhuǎn)移到吸附柱12000r/min離心1min棄濾液。
將吸附柱置回收集管中加500ul 去蛋白液12000r/min離心1min棄
pMD19T連接反應(yīng)體系
10μL總 pMD19T vector 1μL
PCR 產(chǎn)物 3μL dd water
1μL Solution 1 5μL 內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物系本科生基因工程實(shí)驗(yàn)論文 濾液。
將制備管置回離心管加600ul 漂洗液 PW12000r/min離心1min棄
濾液。
重復(fù)上一步操作。
12000r/min空柱離心2分鐘。
向吸附膜的中間部位滴加60μlEB室溫
放置2分鐘12000r/min離心2min。
電泳檢測(cè)以藍(lán)菌落作對(duì)照電泳檢測(cè)T4BAP是否連接并轉(zhuǎn)化成功。點(diǎn)樣順序?yàn)楠?br />質(zhì)粒3個(gè)藍(lán)菌落11個(gè)白菌落。
pEThis、pMD19TBAP的酶切與回收
pEThis、plasmid雙酶切
pEThis質(zhì)粒 DNA雙酶切體系






BAP質(zhì)粒 DNA雙酶切體系




pEThis、BAP膠回收
用 1TAE 和瓊脂糖配制 1%回收膠。
從恒溫水浴鍋中取出酶切產(chǎn)物分別加入4uL的10 Loading Buffer
終止反應(yīng)并混勻。
pEThis膠回收點(diǎn)樣順序?yàn)閜EThis空質(zhì)粒pEThis大片段小樣
pEThis大片段大樣pEThis大片段大樣
pEThis質(zhì)粒DNA雙酶切體系
40μL總 pET
his質(zhì)粒 34μL
Quick HindⅢ 1μL
Quick HindⅠ 1μL
10 Quick Buffer
4 μL
plasmid
質(zhì)粒DNA雙酶切體系
40μL總 p
lasmid
34μL
HindⅢ 1μL
BamH I
1μL
Buffer
4 μL 內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物系本科生基因工程實(shí)驗(yàn)論文 BAP膠回收點(diǎn)樣順序?yàn)閜EThis空質(zhì)粒BAP的PCR 產(chǎn)物pMD19TBAP小片
段小樣pMD19TBAP小片段大樣
電泳結(jié)束后用電話(huà)卡將含有大量酶切產(chǎn)物的泳道切下EB 染色含小樣的
膠塊。在紫外燈下找到目的 DNA 帶用刀片在目的 DNA帶的下上下邊緣
各切一個(gè)小口作為標(biāo)記。
將做好切口標(biāo)記的凝膠與未染色的凝膠原位對(duì)齊根據(jù)小膠條上的切口標(biāo)
記估計(jì)未染色的膠塊上大樣的 DNA 酶切產(chǎn)物的位置。
用刀片切下大膠中 DNA 產(chǎn)物所在的凝膠盡量不要多余的凝膠分別轉(zhuǎn)
移至一個(gè)事先稱(chēng)量過(guò)的、滅活的 微量離心管中。再稱(chēng)量后計(jì)算出
其中膠塊的重量。
再用 EB 染色切除 DNA 以后的大膠與小膠條并在一起在紫外燈下檢查
是否已把 DNA 帶切走。
按照 DNA 凝膠回收試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作回收 DNA 酶切產(chǎn)物。
向吸附柱CA2中加入500μL 的BL12000r/min 1min 離心棄廢
液將吸附柱從新回收到收集管中。
將單一的目的DNA條帶膠塊的離心管中加入3倍體積的溶膠劑PN。
在50℃水浴鍋中放置10 min中間隔23 min輕晃幾次確保膠
體完全融化沒(méi)有膠體顆粒剩余。
將上一步所得的溶液放置室溫后加入吸附柱中室溫放置2分
鐘12000r/min離心 1min。
離心后