【正文】 原的研究、抗原抗體免疫組化定位等方面得到了廣泛應(yīng)用。[目的要求]1. 掌握熒光抗體染色法診斷豬瘟的基本操作步驟。2. 了解熒光抗體技術(shù)的基本原理。[材料與試劑]1. 載玻片，蓋玻片，冰凍切片機(jī)，熒光顯微鏡，2. （）。3. 緩沖甘油：優(yōu)級(jí)純甘油9份和碳酸鹽緩沖液1份混合而成。4. 碳酸鹽緩沖液：。4. 豬瘟熒光抗體，豬瘟抗血清，病豬的扁桃體或腎臟等。[操作方法]1. 切片制備：將冰凍的扁桃體或腎臟進(jìn)行切片，置載玻片上，空氣中自然干燥后，立刻在室溫下放入純丙酮固定15min。2. 洗滌：將固定好的切片以PBS輕輕漂洗5次，每次3min。3. 染色：在晾干的標(biāo)本片上滴加豬瘟熒光抗體（工作濃度），以覆蓋為度，放濕盒內(nèi)置37℃染色30min。 4. 洗滌：取出標(biāo)本片，以吸管吸PBS沖去玻片中的熒光抗體，然后置大量PBS中漂洗5次，每次3min，再以蒸餾水沖洗晾干。5. 封載：染色片半干時(shí)，滴加緩沖甘油封片。本試驗(yàn)需設(shè)定以下對(duì)照：（1） 陽(yáng)性對(duì)照；含有豬瘟病毒的組織所作的切片；（2） 自發(fā)熒光對(duì)照，以PBS代替熒光抗體染色；（3） 抑制試驗(yàn)對(duì)照，標(biāo)本上加未標(biāo)記的豬瘟抗血清，37℃于濕盒內(nèi)中30min后，PBS漂洗，再加標(biāo)記抗體，染色同上。6. 鏡檢：將染色后的標(biāo)本片置熒光顯微鏡下觀察，先用低倍物鏡選擇適當(dāng)?shù)臉?biāo)本區(qū)，然后換高倍物鏡觀察。以油鏡觀察時(shí)，可用緩沖甘油代替香柏油。7. 結(jié)果判定陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)呈翠綠色熒光，而豬瘟自發(fā)熒光對(duì)照組和抑制試驗(yàn)對(duì)照組應(yīng)無(wú)熒光。陽(yáng)性結(jié)果：扁桃體隱窩上皮細(xì)胞或腎曲小管上皮細(xì)胞的胞漿內(nèi)呈明亮的翠綠色熒光，細(xì)胞形態(tài)清晰。陰性結(jié)果：五熒光或熒光微弱，細(xì)胞形態(tài)不清晰。[思考題]1. 熒光抗體染色法的原理是什么?2. 熒光抗體技術(shù)有何優(yōu)點(diǎn)?實(shí)驗(yàn)十 多克隆抗體（免疫血清）的制備免疫血清的制備是一項(xiàng)常用的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。高效價(jià)、高特異性的免疫血清可作為免疫學(xué)診斷的試劑，也可供特異性免疫治療用。用完全抗原物質(zhì)多次免疫動(dòng)物，采取血液，分離血清，即為抗血清或免疫血清，該血清中含有多克隆抗體。具有免疫原性的抗原可刺激機(jī)體內(nèi)相應(yīng)的B細(xì)胞增殖、分化，形成漿細(xì)胞并分泌特異性抗體。由于抗原分子表面的不同抗原決定簇（表位）為不同特異性的B細(xì)胞克隆所識(shí)別，因此由某一抗原刺激機(jī)體后產(chǎn)生的抗體，實(shí)際上為針對(duì)該抗原分子表面不同抗原決定簇的抗體混合物（即多克隆抗體）。另外，根據(jù)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的特點(diǎn)，需要多次重復(fù)注射免疫原，才能產(chǎn)生高效價(jià)及高親和力的抗體。 [目的要求]1. 掌握免疫血清（溶血素和抗菌抗體）的制備方法。2. 掌握免疫原的制備方法。3. 進(jìn)一步熟悉凝集試驗(yàn)的操作過(guò)程及結(jié)果觀察。[材料與試劑]1. 試管，離心管，注射器，平皿，三角燒瓶，2. 肝素液，Hank’s液，生理鹽水，白油，司本80，吐溫80，硬脂酸鋁等。3. 布氏桿菌病試管凝集抗原、布氏桿菌病標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、布氏桿菌病標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，由生物制品廠購(gòu)買。4. 雞紅細(xì)胞，10% 雞紅細(xì)胞，50% 雞紅細(xì)胞，雞，家兔。[實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與操作步驟] （一）抗雞紅細(xì)胞抗體的制備雞紅細(xì)胞懸液（免疫原）的制備從雞翅下靜脈或心臟采血，用肝素抗凝，按抗凝血液的體積，加810倍已滅菌的Hank’s液，輕輕搖勻后，置普通離心機(jī)離心洗滌3次，每次2000r/min離心10mim，棄上清液后，取壓積RBC備用或用無(wú)菌Hank’s液分別配成10% RBC懸液和50% RBC懸液，即為免疫原。 家兔免疫程序(1) 程序1：選用體重2～3 ㎏ 的健康家兔，先飼養(yǎng)觀察7天。用以Hank’s液洗過(guò)3次的壓積紅細(xì)胞進(jìn)行免疫，每日背部皮下注射1次，共5次，、。第6次改用靜脈注射50% 壓積紅細(xì)胞懸液1ml，1日1次，連注3天。末次注射后7d采血，分離血清，分裝，20℃保存?zhèn)溆谩?2) 程序2：選用體重3～4 ㎏ 的健康家兔，先飼養(yǎng)觀察7天。用以Hank’s液洗過(guò)3次的壓積紅細(xì)胞進(jìn)行免疫，皮內(nèi)注射，以后隔日注射1次，從第2次開(kāi)始，均為皮內(nèi)、皮下多點(diǎn)注射，共注射57次，末次注射后7d試血，測(cè)定紅細(xì)胞凝集抗體效價(jià)，若達(dá)1:2000以上時(shí)即可采血，分離血清，分裝，20℃保存?zhèn)溆谩?3) 程序3：選用體重3～4 ㎏ 的健康家兔，先飼養(yǎng)觀察7天。用以Hank’s液配制的10% 紅細(xì)胞進(jìn)行免疫，耳靜脈注射，每日注射1次，共免疫5次，末次注射后7d試血，若紅細(xì)胞凝集抗體效價(jià)達(dá)不到1:2000時(shí)，用50% ，加強(qiáng)免疫二次。(4) 程序4：選體重3～4㎏的健康家兔，先飼養(yǎng)觀察7天。用以Hank’s液配制的10% 紅細(xì)胞進(jìn)行免疫，背部皮下注射，每日1次，連續(xù)5次，第6次耳靜脈注射20% 壓積紅細(xì)胞懸液1ml，第7次耳靜脈注射30% 壓積紅細(xì)胞懸液1ml，第8次耳靜脈注射50% 壓積紅細(xì)胞懸液1ml，1日1次。末次注射后7d采血，分離血清，分裝，20℃保存?zhèn)溆谩?. 抗血清（溶血素）效價(jià)的測(cè)定取試管8支，按下表將溶血素稀釋并加入紅細(xì)胞和生理鹽水，用“+”表示紅細(xì)胞凝集程度，以出現(xiàn)“＋”的最高抗血清稀釋度判定為溶血素效價(jià)。效價(jià)達(dá)1:2000以上者為合格。 溶血素效價(jià)的測(cè)定（單位：ml）分 組管 號(hào)試 驗(yàn) 組對(duì)照組12345678溶血素稀釋倍數(shù)101021032103310341035103溶血素1%紅細(xì)胞生理鹽水混勻,37℃感作1h結(jié)果判定+++++++++++－－－－4. 家兔采血（1）心臟采血法：家兔仰臥保定，左胸部剪毛，消毒皮膚。左手固定心臟，右手用50ml注射器（連接16號(hào)針頭），傾斜45℃，對(duì)準(zhǔn)心搏動(dòng)最強(qiáng)處刺入心臟抽血直至死亡。（2）頸動(dòng)脈放血法：家兔仰臥保定，頭部略放低以暴露頸部，剪毛及消毒皮膚。頸部中線切開(kāi)皮膚約10cm，分離皮下組織，分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區(qū)疏松組織，暴露出頸動(dòng)脈后并使之游離。于動(dòng)脈下套入兩根黑絲線，分別置于遠(yuǎn)心端及近心端。結(jié)扎遠(yuǎn)心端，近心端的動(dòng)脈用血管夾夾住。用小剪刀在兩根絲線間的動(dòng)脈壁上剪一小口，插入塑料放血管（或粗針頭），再將近心端的絲線結(jié)扎固定于放血管上，以防放血管滑脫。松開(kāi)血管夾，使血液流入滅菌三角燒瓶中，一般一只家兔可放血80100ml。5. 免疫血清的提取與保存將心臟抽取的血液立即注入無(wú)菌的大平皿中，置37℃溫箱2h，凝固后用細(xì)針頭沿平皿邊緣將血塊與皿壁脫離，再將血塊劃成豆腐塊，然后放入4℃冰箱過(guò)夜，使血清充分析出。三角燒瓶中的血液先放37℃溫箱2h，用細(xì)玻棒將血塊與瓶壁剝離，4℃冰箱過(guò)夜，使血清充分析出。若血清中帶有紅細(xì)胞或小的血凝塊，則須離心沉淀，去掉紅細(xì)胞和血凝塊。將血清按1:100的比例加入1% 硫柳汞，分裝于滅菌的小瓶?jī)?nèi)，封口，貼上標(biāo)簽，注明免疫血清的名稱，效價(jià)及制備日期，放置低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。（二）抗布氏桿菌抗體的制備， 1. 含油佐劑的布氏桿菌菌體抗原（免疫原）的制備(1) 油相：白油與司本80按94:6的比例混合后，加2％硬脂酸鋁融化混勻，116176。C高壓蒸汽滅菌30 min后即為油相。(2) 水相：布氏桿菌病試管凝集抗原溶液與吐溫80（已滅菌）按96:4的比例混合后即為水相。(3) 乳化：油相（放至室溫后）與水相按1:1比例混合。先將油相傾入組織搗碎機(jī)內(nèi)，在低速攪拌下緩緩加入水相，然后繼續(xù)加速攪拌而成油乳劑苗。(3) 穩(wěn)定性檢驗(yàn)：將制好的含佐劑抗原，于半徑為10cm的離心器中，以3000r/min離心15min，沒(méi)有發(fā)生分層，可以判斷其性質(zhì)穩(wěn)定。2. 不含佐劑的布氏桿菌菌體抗原（免疫原）的制備布氏桿菌病試管凝集抗原與生理鹽水按48:52的比例混合，即為不含佐劑的布氏桿菌菌體抗原，改免疫原所含抗原量與佐劑抗原的抗原量相同。3. 家兔免疫程序(1) 程序1：選用體重2～3 ㎏ 的健康家兔(最好雄性)，先飼養(yǎng)觀察7天。將含佐劑抗原或不含佐劑抗原于家兔背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射，免疫時(shí)間是第15天，免疫劑量分別是：、末次免疫后7d采血。(2) 程序2：選用體重2～3 ㎏ 的健康家兔(最好雄性)，先飼養(yǎng)觀察7天。將含佐劑抗原或不含佐劑抗原于家兔背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射，免疫時(shí)間是第15天，免疫劑量分別是： 、末次免疫后7d采血。4. 抗血清效價(jià)的測(cè)定用布氏桿菌試管凝集試驗(yàn)（參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)一中的布氏桿菌試管凝集試驗(yàn)操作方法）對(duì)抗血清進(jìn)行凝集效價(jià)的測(cè)定。用“+”表示顆粒性抗原的凝集程度，以出現(xiàn)“＋”的最高抗血清稀釋度判定為凝集效價(jià)，凝集效價(jià)一般可達(dá)到1:400以上。[思考題]1. 家兔在免疫前為什么先飼養(yǎng)觀察7天？2. 制備溶血素時(shí)，免疫原為什么不用加佐劑？3. 你還有其它的制備溶血素或抗菌抗體的免疫程序么？26