【導(dǎo)讀】邊緣部分染色較深，中心較淺，直徑7—8微米。嗜中性顆粒白血球：體積略大于紅細(xì)胞，細(xì)胞核被染成紫色分葉狀，葉，胞質(zhì)充滿嗜酸性大圓顆粒，被染成鮮紅色。小淋巴細(xì)胞與紅血球大小。周圍僅有一薄層嗜鹼性。染成淡藍(lán)的細(xì)胞質(zhì)。中淋巴細(xì)胞較大，有較寬層的細(xì)胞，核圓形。細(xì)胞呈圓形或卵圓形，胞質(zhì)豐富，呈嗜鹼性。于細(xì)胞的一側(cè)，染色質(zhì)核膜呈車輪分布。正常組織漿細(xì)胞少，慢性炎。漿細(xì)胞合成和分泌抗體，對(duì)免疫有重要意義。稱取瑞特氏染料克溶于60ml甲醇中，過濾。沉淀物主要是由抗體蛋白所組成。此外還有放射性同位素標(biāo)記、酶標(biāo)記等測定法。形成一個(gè)乳白色的環(huán)狀物即為陽性沉淀反應(yīng)。預(yù)熱數(shù)分鐘后等量混合均勻制成免疫瓊脂板。4．已經(jīng)加樣的免疫瓊脂板置濕盒中37℃溫箱擴(kuò)散24小時(shí)。使樣品外溢或在邊緣殘存小氣泡，以免影響擴(kuò)散結(jié)果。72小時(shí)仍未出現(xiàn)沉淀線則為陰性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)至少要做一陽性對(duì)照。

　　

【正文】 1 管內(nèi)。 3．用另一支吸管吸取無菌生理鹽水 毫升，加入第二管內(nèi)。 4．再用吸管吸取傷寒桿菌培養(yǎng)液，分別加入 1及 2 管中各 毫升。加菌液時(shí)，防止菌液接觸管壁以免污染管壁，造成結(jié)果的錯(cuò)誤。然后振蕩兩支試管使之均勻混合，置 37℃水浴箱中。 1． 取普通瓊脂平板一塊，用蠟筆在底上劃分為四等分，分別標(biāo)記為 1039。， 3039。， 6039。，對(duì)照 (如圖 )。 待血清與菌液作用 10 分鐘后，取出 1 號(hào)試管加以加以振蕩，使細(xì)菌均勻懸于液體中，然后采一接種菌液劃線接種于培養(yǎng)基 1039。部分，再將試 管放回水浴箱中繼續(xù)培養(yǎng)。于30 分及 60 分后，再取出 1 號(hào)試管各采一接種環(huán)菌液分別劃線接種于培養(yǎng)基相應(yīng)部分。 2 號(hào)試管只于作用 60 分鐘取出，采一接種環(huán)菌劃線接種于培養(yǎng)基的對(duì)照部分。 2． 將平板放 37℃溫箱中培養(yǎng) 24 小時(shí)。觀察各試驗(yàn)部分及對(duì)照部分生長的細(xì)菌菌落數(shù)目。分析經(jīng)血清與生理鹽水作用后細(xì)菌死亡情況及其與時(shí)間的關(guān)系。 二．溶菌酶的殺菌作用 唾液溶菌酶試驗(yàn) 唾液里含有溶菌酶，能溶解革蘭氏陽性菌，是機(jī)體非特異性免疫因素之一。溶菌酶對(duì)于革蘭氏陽性菌的作用在于裂解細(xì)胞壁中的乙酰胞壁酸和乙酰葡糖胺之間的連接，可導(dǎo) 致細(xì)菌死亡。測定體液中溶菌酶含量的變化，認(rèn)為可以反映非特異性免疫功能一個(gè)方面。 材料： 1． 細(xì)菌培養(yǎng)物 2． %無菌生理鹽水 3． 小試管 2 支；平皿 1 個(gè)； 1 ml 移液管 3 支 方法： 1．試驗(yàn)前一天，將細(xì)菌移種普通斜面 37℃培養(yǎng) 24 小時(shí)，用生理鹽水洗下菌苔稀釋至適當(dāng)濃度 (722 型分光光度計(jì)上波長 450 納米 光密度 )。 2．唾液流入無菌平皿內(nèi)，以備用。 3． 取 2 支小試管，加菌液 ，向第一管加唾液 ml，向第二管加唾液 ml 作為對(duì)照。將兩支小試管放 37℃水浴箱保溫 30 分鐘。 觀察結(jié)果： 第 1 管 澄清透明， 第 2 管仍渾濁 一． 吞噬作用 (一 )白血球的噬菌作用 材料： 1．動(dòng)物 —— 小白鼠 2．菌種 —— 甲型鏈球菌菌液 3．無菌注射器及針頭，玻璃毛細(xì)管，美蘭染液，玻片，無菌肉湯，滅菌小棉花包。 方法： 1． 試驗(yàn)前 3— 6 小時(shí)。將無菌肉湯 2— 3 毫升注射入小白鼠腹腔內(nèi)引起大量白血球聚集于小白鼠腹腔內(nèi)。 2．將 1ml 甲型鏈球菌菌液注入小白鼠腹腔。 3．注射后用毛細(xì)吸管輕輕刺入小白鼠腹腔吸取腹腔液。經(jīng) 5ˊ、 10ˊ、 20ˊ、 40ˊ后，分 別取腹腔液滴于玻片上制成涂片，經(jīng)自然干燥后，用稀釋的美藍(lán)液染色一分鐘后鏡檢。 4．鏡檢時(shí)尋找白血球，觀察細(xì)胞染液中有無吞噬的細(xì)菌。 結(jié)果觀察： 細(xì)菌及細(xì)胞核呈深蘭色，細(xì)胞漿呈淡蘭色，在不同時(shí)間的涂片中，可看到處于不同階段的吞噬現(xiàn)象。 (二 )巨噬細(xì)胞吞噬紅血球的作用 (示教 ) 材料： 1．動(dòng)物 小白鼠 2． 25%雞紅血球懸液， 1%可溶性淀粉，無菌注射器及針頭。 方法： 1． 48～ 72 小時(shí)以前無菌漿糊 1ml 注入小白鼠腹腔內(nèi)。 2． 48～ 72 小時(shí)之后在腹腔注入 25%洗滌過的雞紅血球懸液 1ml。 3．血球注入后經(jīng) 30 分鐘至 1 小時(shí)后，用毛細(xì)管取腹腔液制成涂片，待干后用瑞氏染液染色鏡檢。 4．同法于 1 小時(shí)、 2 小時(shí)后再作一次腹腔液涂片染色鏡檢。 結(jié)果觀察： 雞紅細(xì)胞呈橢圓，有細(xì)胞核，經(jīng)染色后胞漿呈粉紅色，核呈紫藍(lán)色。一個(gè)巨噬細(xì)胞可吞噬數(shù)個(gè)雞紅細(xì)胞，吞噬后經(jīng)消化的雞紅細(xì)胞輪廓不清。 附：小白鼠腹腔注射法 1. 用消毒好的注射器，按無菌操作法抽菌懸液后，再用無菌鑷子夾一滅菌棉花包，將針頭刺入棉花包內(nèi)，排出注射器內(nèi)的氣泡，然后將注射器平擔(dān)于試管架上。 2. 固定小白鼠：用右手輕拖鼠尾，使其趴在金屬網(wǎng) 蓋上，再突然用左手拇指和食指抓緊小白鼠頸部及兩耳，將鼠體收入手掌中，再用左手無名指和手掌夾住小白鼠尾根，以無名指和小指夾住其左腿。 3. 以無菌鑷子取碘酒棉球，消毒小白鼠左下腹部，用鑷子取去注射器針頭上的棉花包放入消毒罐中。左手傾斜使小鼠頭部向下，然后將注射器針頭自小白鼠左側(cè)腹股溝部刺入皮下，使針頭在皮下組織內(nèi)前進(jìn)約 1 厘米左右，再直立注射器，輕輕向下刺入腹腔內(nèi) (這樣可防止拔針后注入的材料外溢 )。注入菌液 1 毫升后將針頭退出。然后將小白鼠用染料作好標(biāo)記。如用復(fù)紅 (紅色 )，美藍(lán) (蘭色 )放入動(dòng)物罐中 。 圖 11 小白鼠腹腔注射法示意圖 實(shí)驗(yàn)二 50%溶血試驗(yàn) (CH50)測定補(bǔ)體 50%溶血試驗(yàn)即求得能使 50%致敏羊紅細(xì)胞發(fā)生溶血的最小量血清，然后計(jì)算出每毫升血清中補(bǔ)體含量。 溶血百分?jǐn)?shù) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 補(bǔ)體量 圖 12 由溶血素致敏洋紅細(xì)胞的溶血程度與腸鼠血清 (補(bǔ)體 )量增加之間的關(guān)系 以補(bǔ)體量作為橫坐標(biāo)，溶血百分?jǐn)?shù)作為縱坐標(biāo)，可得到 一個(gè)清晰的“ S”形曲線。在 50%溶血周圍，線段近似一條直線。因此當(dāng)補(bǔ)體用量稍有變動(dòng)，就可對(duì)溶血程度發(fā)生很大影響。所以用 50%溶血作為終點(diǎn)要比100%溶血更為敏感。 50%溶血試驗(yàn)定血清中補(bǔ)體含量用以下公式表示： 該公式可以從 Von Krogh 方程式進(jìn)一步加以論證： 假定 X=加入的新鮮血清量 y=溶血的百分率，以小數(shù)表示 V=斜率 k=常數(shù) 轉(zhuǎn)變成對(duì)數(shù)，上述公式就變成 當(dāng)以 50％溶血作為終點(diǎn)時(shí)，代入上述公式，由于－ log1＝ 0，也即表示補(bǔ)體的 50％溶血單位就是加入的新鮮血清量。 材料及器材 1．稀釋液 (磷酸鹽緩沖生理鹽水 ) NaCl 17g Na2HPO4 11g KH2PO4 蒸餾水 100ml 使用時(shí)取此原液 50ml，加 90ml 蒸餾水。經(jīng)高壓滅菌后即可使用。加入 100%硫酸鎂溶液 1ml，可增強(qiáng)補(bǔ)體的效能。 2．綿羊紅細(xì)胞懸液 (1 10g/ml) 3．溶血素 (2U) 4．被檢血清 (新鮮豚鼠血清 ) 5．水平離心機(jī) 6．水浴箱 7． 721 型分光光度計(jì) 方法： 1．濃度為 1 10g/ml 的綿羊紅細(xì)胞配制 取經(jīng)稀釋洗滌后的綿羊紅細(xì)胞配成較 5%稍濃的細(xì)胞懸液。 取 50%細(xì)胞懸液 1ml，加于 14ml 蒸餾水中測值為。按下式求出于一定體積的 5%細(xì)胞懸液中應(yīng)加入稀釋液的毫升數(shù)。 為配制的 50%細(xì)胞懸液體積，為于一定量 5%細(xì)胞懸液中應(yīng)加入稀釋的 ml 數(shù)：為已知標(biāo)準(zhǔn)化的１ 100 個(gè)細(xì)胞／ ml 懸液的 540 值─。 ２．致敏綿羊細(xì)胞 取綿羊紅細(xì)胞懸液 (1 10２／ ml)加等量的溶血素 (２ U／ｍｌ )。充分混合。置 37℃水浴中作用３０分鐘，每隔 10 分鐘搖動(dòng)一次以免細(xì)胞下降即成 5 10８／ ml 致敏羊紅細(xì)胞。 ３．補(bǔ)體 CH50 單位測定 ? 按下表加樣： 試管號(hào) 需加試劑 (ml)123456 (溶血對(duì)照 )7 (血球?qū)φ?)8 (血清對(duì)照 ) 1： 800 血清樣品 ——— 1： 80 血清樣品 ——————— 致敏綿羊紅細(xì)胞 — 稀釋液 — 蒸餾水 —— ——— —— ? 將各管充分混合。置 37℃水浴中６０分鐘 (搖動(dòng)１～２次，以免紅細(xì)胞下沉。 ) ?從水浴中取出后，立即將各管以2020轉(zhuǎn)／分離心１０分鐘，將各管上清液分別移于另一試管。 ?測定各管上清液ＯＤ值 (波長＝５４０ｎｍ ) ４．補(bǔ)體ＣＨ５０單位的計(jì)算 從測定管 (第１～５管 )及溶血對(duì)照管 (第６管 )的ＯＤ值中減去紅細(xì)胞對(duì)照管 (第７管的ＯＤ值。再減去按待測血清每管實(shí)際用量計(jì)算出的血清色度ＯＤ值 (８０／８００ⅹ該管實(shí)際量ⅹ第８管ＯＤ值 )。即為測定管的校正ＯＤ值。然后計(jì)算各測定管的溶血率 (ｙ值 ) 再計(jì)算各 管的ｙ／ (１－ｙ )值。 在雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上，以ｙ／ (１─ y)值為橫坐標(biāo)，血清用量為縱坐標(biāo)，得到一條直線。由于 50%溶血 (y=)的 y/(1─ y)值等于 1。即可由橫坐標(biāo)等于 1 的一點(diǎn)，在直線上求得在縱坐標(biāo)上相應(yīng)的截距，此即產(chǎn)生50%溶血的待測血清實(shí)際用量。 最后，按下列公式計(jì)算出每毫升待測血清的總補(bǔ)體活性，以單位/毫升表示之。 實(shí)驗(yàn)九 血球凝集和血球凝集抑制試驗(yàn) 病毒的血清學(xué)反應(yīng)與其他微生物的血清學(xué)反應(yīng)相同，即可已知抗原測未知抗體或用已知抗體測未知抗原。常用的方法有血凝抑制、補(bǔ)體結(jié)合等。 病 毒導(dǎo)致紅細(xì)胞凝集的原因還不十分清楚，但對(duì)流感病毒的血凝一般解釋為病毒包膜上的血凝素，作用于紅細(xì)胞表面的受體而產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。已知能與流感病毒發(fā)生血凝現(xiàn)象的動(dòng)物紅細(xì)胞至少有 22 種。其中以雞、豚鼠、人的紅細(xì)胞應(yīng)用得最多。而在血球與病毒混合前加入病毒的特異性抗體，則血球凝集現(xiàn)象不出現(xiàn)，此稱血球凝集有抑制現(xiàn)象，借此可以鑒定病毒或測定體內(nèi)的抗體。 材料： 1. 新城雞瘟病毒 2. %雞紅細(xì)胞 3. 抗雞瘟病毒血清 4. 生理鹽水、大孔塑料板、小孔塑料板 5. 稀釋棒： (用于血凝 )， (用于血凝抑制 ) 6. 定量滴頭： 1ml 注射器上加 16 號(hào)針頭，經(jīng)其口滴出液體 1 滴相當(dāng)于 。 一．血球凝集 依下表加入各樣品 (單位： ml) 孔號(hào)生理鹽水病毒液病毒稀釋度 ％雞紅細(xì)胞搖勻后室溫或 4℃經(jīng)30～ 60 分鐘結(jié)果 結(jié)果判定：觀察結(jié)果，切勿將板振搖，應(yīng)輕輕拿起，觀察孔底。凡出現(xiàn)凝集者，血球沉于孔底呈平鋪象倒張的傘狀，邊緣有卷起的趨向。陰性者，血球孔底形成一個(gè)小團(tuán)，光滑圓潤，邊緣整齊者。 各孔凝集結(jié)果以 +++， ++， +， 表示 ++++全部血球凝集，一層紅細(xì)胞均勻鋪于孔底，呈顆粒狀薄膜，邊緣不整齊。 +++基 本同上，大約 75%血球凝集，但邊緣不整有下垂趨向者。 ++約有 50%血球凝集，血球在孔底形成環(huán)狀，四周有小凝集塊。 +約有 25%血球凝集，血球于孔底形成一個(gè)小團(tuán)，四周有小凝集塊。 不凝集，血球沉于孔底中心，呈一致密的圓點(diǎn)，光滑圓潤。 凝集效價(jià)：能使血球呈 ++凝集的病毒最高稀釋度為凝集效價(jià)，即含一個(gè)血凝單位，實(shí)用時(shí)應(yīng)用 毫升病毒懸液中含 4 個(gè)血凝單位。若血凝單位為 1： 320，故抗原稀釋度應(yīng)為 1： 80，由于試驗(yàn)時(shí)用量為 毫升，故含 4 單位應(yīng)為 1： 40。 二 .血凝抑制試驗(yàn) 依下表加入各種品 (單位： ml) 孔號(hào)血清稀釋度抗血清鹽水抗原混勻后作用 10 分鐘 ％雞紅細(xì)胞懸液各 毫升稍加振蕩置室溫 60 分鐘結(jié)果 11/ 21/ 31/ 41/ 51/ 61/ 71/ 81/ 9 血清對(duì)照 鹽水 10 血球?qū)φ?— — 最高稀釋孔仍呈完 全抑制凝集，該血清稀釋度即為血凝抑制效價(jià)。 三．微量血凝及血抑試驗(yàn) 方法： 1. 滴定血凝效價(jià)：先用定量滴頭按下表，第 1 孔加 8 滴，其余每孔加 2 滴，然后用大號(hào)螺旋圈吸滿病毒液順次稀釋至第 10 孔。每孔加 %雞血球 2 滴。下表內(nèi)的單位為滴數(shù)。 孔號(hào)病毒稀釋度 (1)生理鹽水 (2)病毒 1 螺旋圈 (3)％雞血球 11： 58 2 21： 102 2 31： 202 2 41： 402 2 51： 802 2 61： 1602 2 71： 3202 2 81： 6402 2 91： 12802 2 101： 25602 2 11 棄去 12 對(duì)照 2 2 2. 室溫靜置 30— 40 分鐘后肉眼觀察結(jié)果，必要時(shí)可用放大鏡觀察，計(jì)算結(jié)果與試管法同以 ++為終點(diǎn)。 3. 血凝抑制試驗(yàn)：將試驗(yàn)血清按下表稀釋，首先按表滴數(shù)加生理鹽水，然后加入第 第 2 及第 3 孔以試驗(yàn)血清，用小號(hào)螺旋圈順次稀釋。 孔號(hào)血清稀釋度材料 生理鹽水血清 (1： 10)病毒 (4U)％雞血球 1 血清對(duì)照 11— 2 21： 10— 112 31： 202020 41： 401 12 51： 801 12 61： 1