【導(dǎo)讀】員不允許在檢查室內(nèi)滯留。工作人員在操作間內(nèi)必須穿戴工作衣、帽。及必要的隔離著裝。每次進(jìn)入或離開實(shí)驗(yàn)室都需查看并核對(duì)實(shí)驗(yàn)室工具、儀。注意人身及設(shè)備的安全，做實(shí)驗(yàn)時(shí)要有安全措施。結(jié)果可靠、結(jié)論正確。算機(jī)進(jìn)行非工作性質(zhì)的運(yùn)作。，注意試劑及耗材的有效日期和保管方式，實(shí)驗(yàn)室的昂貴設(shè)備，未經(jīng)管理人員許可，任何人不得擅自開。實(shí)驗(yàn)人員要對(duì)自己的實(shí)驗(yàn)過程的清潔衛(wèi)生負(fù)責(zé)，按衛(wèi)生制度要求消毒。，工作人員每日下班前應(yīng)檢查水、電，防止意外事故發(fā)生。、尖銳器具的處理應(yīng)符合醫(yī)院感染控制規(guī)范要求。得到醫(yī)務(wù)處或主管院長(zhǎng)批準(zhǔn)并登記，并及時(shí)向主管部門報(bào)告。由于責(zé)任事故造成儀器設(shè)備的損壞，要追究。備進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)故障及時(shí)安排維修，提高設(shè)備完好率。高檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。故障時(shí)，必須先切斷電源后，方可進(jìn)行檢查。

　　

【正文】 所有與器官移植專業(yè)相關(guān)的淋巴細(xì)胞交叉反應(yīng)試驗(yàn)。 Ⅲ . 責(zé)任人： 實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)員。 Ⅳ . 規(guī)程： 1 實(shí)驗(yàn)器材和試劑： 微量反應(yīng)盒． 微量加樣器。 倒置熒光顯微鏡 2 步驟： 取 2ml 左右供者全血加入放有 5ml 淋巴細(xì)胞分離液的試管，2020 轉(zhuǎn) /分離心 10 分鐘 吸取中層淋巴細(xì)胞液放入約 中，離心 8 分鐘，倒上清，留底層淋巴細(xì)胞，振蕩，調(diào)細(xì)胞濃度約 2xl06／ m1 加入供體淋巴細(xì)胞懸液每孔 3μl于微量反應(yīng)盒 每孔 加入受者血清 2μl，使血清沉到孔底。 輕輕振動(dòng)，使細(xì)胞和血清充分混合。 37℃土 2℃培育 30 min。 加入免補(bǔ)體 1μl，留一孔不加為對(duì)照， 37℃土 2℃培育 60 min。 加入熒光素二醋酸酯 (Fluorescein diacetate) 3μl標(biāo)記淋巴細(xì)胞。 37℃土 2℃培育 1525min。 3 讀數(shù)方法和記分標(biāo)準(zhǔn) 41 在例置相差熒光顯微鏡下活細(xì)胞帶綠色熒光，死細(xì)胞帶紅色熒光。計(jì)算死細(xì)胞和活細(xì)胞的比例。 42 十八、 FK506 濃度檢測(cè) 1 儀器與試劑 全血沉淀劑 Mode1 標(biāo)準(zhǔn)品和各級(jí)質(zhì)控品 IMx 儀器，離心機(jī) FK506 試劑盒 2 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 從冰箱里拿出 Mode1 標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品平衡至室溫。 用 100%的酒精沖洗儀器的進(jìn)樣器。 了解儀器緩沖液是否足夠。 了解儀器打印機(jī)紙張是否足夠。 廢液瓶是否為空。 并打開儀器電源。 考慮標(biāo)本量與儀器容量的情況，決定每次實(shí)驗(yàn)標(biāo)本數(shù) 3. 樣品預(yù)處理 充分振蕩混 勻 Mode1 標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)控品和樣品后，并分別將150ul 的樣品液加入到離心管中。 注意：移液量需精確，每次移液后需更換移液的槍頭。 將 150ul 的全血沉淀劑分別加入每個(gè)樣品離心管中，蓋好管帽后，立即用漩渦振蕩儀充分振蕩，確保其充分混勻。 注意：離心管底不能出現(xiàn)混合不徹底的沉淀物，如果有，通過翻轉(zhuǎn)和輕敲管底使其活動(dòng)起來，重新對(duì)樣品進(jìn)行高速旋轉(zhuǎn)。 43 將離心管放入離心機(jī)，保證離心的速度和時(shí)間（ 13000 轉(zhuǎn)， 6分鐘） 離心后迅速將離心管中上清液倒入各反應(yīng)杯，并放置好轉(zhuǎn)盤按儀器上的 RUN 鍵立即檢 測(cè)。 （進(jìn)行定標(biāo)時(shí)采用 model 1 按鈕） 注意：離心后，樣品不能在離心管中超過 10 分鐘。 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處理 需要進(jìn)行再次實(shí)驗(yàn)的試劑充分混勻。 結(jié)束實(shí)驗(yàn)時(shí)，將管路沖洗一次， 100%的酒精沖洗儀器的進(jìn)樣器。 傾倒實(shí)驗(yàn)廢液。 關(guān)閉電源 5 結(jié)果分析 了解質(zhì)控是否在所定范圍內(nèi)。 了解 model 1 參數(shù)值在 200 以上（ 400 多較好）， factor= 1+/。 每更換試劑盒必須重新定標(biāo)，定標(biāo)誤差值小于 10%。違反以上標(biāo)準(zhǔn)重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 44 十九、西羅莫司濃度檢測(cè) 3 儀器與試劑 全血沉淀劑 Mode1 標(biāo)準(zhǔn)品和各級(jí)質(zhì)控品 IMx 儀器，離心機(jī) 西羅莫司試劑盒 4 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 從冰箱里拿出 Mode1 標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品平衡至室溫。 用 100%的酒精沖洗儀器的進(jìn)樣器。 了解儀器緩沖液是否足夠。 了解儀器打印機(jī)紙張是否足夠。 廢液瓶是否為空。 并打開儀器電源。 考慮標(biāo)本量與儀器容量的情況，決定每次實(shí)驗(yàn)標(biāo)本數(shù) 3. 樣品預(yù)處理 充分振蕩混勻 Mode1標(biāo)準(zhǔn)品 ,質(zhì)控品和樣品后，并分別將 150ul的樣品液加入到離心管中。 注意：移液量需精確，每次移液后需更換移液的槍頭。 將 300ul 的全血沉淀劑分別加入每個(gè)樣品離心管中，蓋好管帽后，立即用漩渦振蕩儀充分振蕩，確保其充分混勻。 注意：離心管底不能出現(xiàn)混合不徹底的沉淀物，如果有，通過翻轉(zhuǎn)和輕敲管底使其活動(dòng)起來，重新對(duì)樣品進(jìn)行高速旋轉(zhuǎn)。 45 將離心管放入離心機(jī)，保證離心的速度和時(shí)間（ 13000 轉(zhuǎn)， 6分鐘） 離心后迅速將離心管中上清液倒入各反應(yīng)杯，并放 置好轉(zhuǎn)盤按儀器上的 RUN 鍵立即檢測(cè)。 （進(jìn)行定標(biāo)時(shí)采用 model 1 按鈕） 注意：離心后，樣品不能在離心管中超過 10 分鐘。 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處理 需要進(jìn)行再次實(shí)驗(yàn)的試劑充分混勻。 結(jié)束實(shí)驗(yàn)時(shí)，將管路沖洗一次， 100%的酒精沖洗儀器的進(jìn)樣器。 傾倒實(shí)驗(yàn)廢液。 關(guān)閉電源 5 結(jié)果分析 了解質(zhì)控是否在所定范圍內(nèi)。 報(bào)告結(jié)果 46 二十、 CMVpp65 抗原檢測(cè) Ⅰ . 目的 ：確保 器官移植專業(yè)臨床試驗(yàn)規(guī) 范化。 Ⅱ . 范圍 ： 所有與器官移植專業(yè)相關(guān)的 CMVpp65 抗原檢測(cè)。 Ⅲ . 責(zé)任人： 實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)員。 Ⅳ . 規(guī)程： 1. 試劑與儀器 CMVvue FITC 試劑盒（ Diasorin,USA） 分析純 3638％甲醛 記號(hào)筆、蒸餾水或去離子水 吸頭、加樣器、吸管、一次性試管、濕盒 37 度溫箱 熒光顯微鏡 2. 操作步驟 從外周血中分離白細(xì)胞 用 1 升（ 1000ml）雙蒸水或去離子水溶解 PBS(PHosPHATE BuFFeDSaLNE) 取 3177。 EDTA 或肝素抗凝血，加入 配好的 PBS,再加入 CMVVUE Dextram（白細(xì)胞分離劑），顛倒混勻幾次， 37℃水浴箱中傾斜放置 15~20 分鐘 吸白細(xì)胞層，放入另一個(gè)試管內(nèi)， 10001500rpm（每分鐘多少轉(zhuǎn)）離心 5~10 分鐘，棄去上清 加入 35ml 稀釋好的紅細(xì)胞裂解液（ CMVVUE Lysing Medium），室溫靜置 3~5 分鐘 (注：紅細(xì)胞裂解液用蒸餾水 10 倍稀釋 47 （ 1： 9），溶解紅細(xì)胞，若還有紅細(xì)胞則再次溶解 )， 10001500 rpm 離心 5~10 分鐘，棄去上清 加入 35ml PBS 洗白細(xì)胞層 ,10001500 rpm 離心 5~10 分鐘，棄去上清 ,重復(fù)一次。 白細(xì)胞標(biāo)本的制備 用 PBS 調(diào)細(xì)胞濃度達(dá)到 4106 個(gè)細(xì)胞 /ml 將 1520ul 白細(xì)胞涂于玻片上 ,加時(shí)要慢慢加入使其分布均勻，先加周圍再加中間，將細(xì)胞涂開 37℃干燥箱 510 分鐘使其 風(fēng)干，或室溫自然風(fēng)干，一定要使細(xì)胞干，注意細(xì)胞懸浮液不要相互污染 配固定液 :用濃縮固定液 (inplete firative conc)與 37%甲醛 7:1 混合 ,再用蒸餾水 10 倍稀釋 用已配 好的固定液固定細(xì)胞層 10~11 分鐘 用 PBS 輕輕沖二遍 ,在 PBS 內(nèi)泡兩分鐘，取出玻片，用吸水紙把細(xì)胞團(tuán)旁邊的多余水分拭去，立即染色 染色 每個(gè)樣本玻片和陽性、陰性質(zhì)控玻片上加 16～ 25ul 單抗(CMVVUE FITC Mab)， 37℃水浴箱溫育 30 分鐘，注意不要干片 用 PBS 輕輕沖幾遍 ,在 PBS 內(nèi)泡 2~3 分鐘 取出玻片，用吸水紙把細(xì)胞團(tuán)旁邊的多余水分拭去，立即加入 16～ 25ul 二抗 (CMVVUE FITC Conjugatt)， 37℃水浴箱溫育 30分鐘以上，注意過程中不要干片 用 PBS 輕輕沖幾遍 (要多沖 ),泡 5 分鐘 封片 : 取出玻片，用吸水紙把細(xì)胞團(tuán)旁邊的多余水分拭去，將半滴 Mounting Medium 液滴于玻片上，蓋上蓋片 48 觀察結(jié)果 200400 倍 Uv 顯微鏡下觀察質(zhì)控和樣本玻片，陽性質(zhì)控?zé)晒夂巳旧珣?yīng)為綠色， CMV 感染的成纖維細(xì)胞也為綠色，陰性質(zhì)控的成纖維細(xì)胞沒有特異性熒光。病人的樣本顯綠色單核或多核染色時(shí)可判斷是陽性結(jié)果，陰性標(biāo)本沒有特異性熒光，當(dāng)細(xì)胞漿 染色而核不染色都應(yīng)認(rèn)為是陰性結(jié)果