免疫學檢測與免疫學技術-資料下載頁
2025-09-30 15:05本頁面
【正文】 變； ? *細胞壞死時 ,ATP和蛋白質(zhì)合成抑制及終止 。細胞凋亡時 ,ATP、 mRNA和蛋白質(zhì)合成依舊 ,細胞第二信號系統(tǒng)仍活動 。 ? *細胞壞死時 ,細胞 DNA隨機降解 ,電泳不呈梯狀圖譜 。細胞凋亡時 ,DNA多降解成 180～ 200bp或其倍數(shù)的梯狀片段 ,電泳呈梯狀圖譜 。 ? *細胞壞死時 ,細胞內(nèi)容物外溢 ,引起局部炎癥反應或組織損傷 。細胞凋亡時 ,細胞內(nèi)容物不外溢 , 所以不引起炎癥反應或局部損傷 。 ? *細胞壞死時 ,往往是成團細胞死亡 。細胞凋亡時 ,在組織中呈分散狀態(tài)分布。 ?三 、 研究細胞凋亡的意義 ? 1. 細胞凋亡在腫瘤形成和治療中具有重要作用 。 ? *凋亡基因與抗凋亡基因突變 ? →→ 易形成腫瘤； ? *免疫效應細胞表達 FasL, ? 腫瘤細胞表達 Fas→→ 誘導腫瘤細胞凋亡 ? →→ 抗腫瘤 ? *腫瘤細胞高表達 FasL→→ 誘導免疫細胞凋亡 ? →→ 抑制免疫功能 →→ 逃避免疫監(jiān)視 ? *腫瘤細胞低表達或不表達 Fas ? →→ 逃避免疫監(jiān)視 ? 2. 細胞凋亡與免疫學的關系 ? *細胞凋亡與 T細胞在胸腺的發(fā)育 ? *細胞凋亡與成熟 T細胞： AICD ? *細胞凋亡與與 B細胞 ? *細胞凋亡與胞毒效應 ? ? ? *抗病毒免疫防御 ? *細胞凋亡與 AIDS ? *細胞凋亡與病毒性肝炎 細胞凋亡的檢測方法 ? 一 、 形態(tài)學方法 ? 1． 普通光學顯微鏡檢測法 ? 2． 熒光顯微鏡檢測法 ? 材料： ① 石蠟切片 。② 冰凍切片 。③ 細胞學涂片 。 ? 方法一： ① PI染液：碘化丙啶 (propidium iodide,PI)； ② DAPI染液； ③ AO染液： ? *熒光顯微鏡下觀察 。 PI染色選用 600nm的激發(fā)光 ,DAPI選用 460～ 500nm的激發(fā)光 ,AO染色選用 520nm的激發(fā)光 。 ? * HE 染色核 DNA 呈藍色 , 而 PI 染色呈紅色 ,DAPI染色呈藍白色 ,AO染色呈黃綠色 。 凋亡細胞呈現(xiàn)核濃縮 ,染色加深 ,或核染色質(zhì)呈新月形聚集于核膜一邊 。晚期凋亡細胞表現(xiàn)為核碎裂成大小不等的圓形小體被細胞膜包繞 ,即凋亡小體 。 ?方法二： Hoechst 33342/PI雙標記法 ? *在熒光顯微鏡下觀察 ， 凋亡細胞的藍色熒光比活細胞和非凋亡細胞都要強 ，其光散射能力則降低 ， 將二者結合起來 ，可以很好地鑒定凋亡細胞 。 壞死細胞則由于 PI復染 ， 呈紅色熒光 。 是目前細胞凋亡最滿意的形態(tài)學分析方法 。 ? *樣品來源 培養(yǎng)細胞或離體細胞制成的單個細胞懸液 。 ?方法三：碘化丙啶 （ PI） 和 Hoechst 33342(HO)雙染法 ? PI和 HO均可使用紫外光激發(fā) ， 其熒光分別為紅光和藍光 。 對照活細胞的 HO藍色熒光最強 ， 而早期凋亡細胞由于其DNA降解和丟失 ， 其 HO藍色熒光較弱 ，也有很弱的 PI紅色熒光 。 晚期凋亡細胞PI紅色熒光增強 ， 壞死細胞 PI紅色熒光最強 ， 而 HO藍色熒光較弱 。 ? 3． 凋亡小體的電鏡觀察 小體系由細胞膜卷曲 、 脫落形成的小泡 ,其內(nèi)包含有完整的細胞器及核片段 。 ?二 、 生物化學方法 ? 電泳法 DNA梯帶 (DNA ladder)。 ?三 、 免疫學方法 (ELISA法 ) ? *細胞凋亡的發(fā)生 ,是由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活 ,核小體間區(qū)雙鏈 DNA解開 ,產(chǎn)生單 /低聚核小體片段 ,而核小體 DNA由于與組蛋白 H2A、 H2B、 H3和 H4形成緊密復合物而不被核酸內(nèi)切酶裂解 。 ?采用雙抗體夾心酶免疫法 ,應用小鼠抗DNA和抗組蛋白的單克隆抗體 ,與核小體片段形成夾心結構 ,可特異性檢測細胞溶解物中的單 /低聚核小體。 ?四 、 原位末端轉移酶標記技術 (TdT或TUNEL) ? 凋亡細胞由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活 ,核DNA被切割成許多雙鏈 DNA片段以及高分子量DNA單鏈斷裂點 (缺口 ),暴露出大量 339。羥基末端 ,如用 (TdT)將標記的 dUTP進行缺口末端標記 ,則可原位特異地顯示出凋亡細胞 。 ? (一 )熒光標記法 ? *采用美國 Oncor公司 ApopTag TM 試劑盒 ，或德國 Boehringer Mannheim公司 In Situ Cell Death Detection試劑盒 ? (二 )酶標記法 ? *采用美國 Oncor公司 ApopTagTMPeroxidase試劑盒
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