免疫學(xué)檢測(cè)與免疫學(xué)技術(shù)-資料下載頁(yè)
2025-09-30 15:05本頁(yè)面
【正文】 變； ? *細(xì)胞壞死時(shí) ,ATP和蛋白質(zhì)合成抑制及終止 。細(xì)胞凋亡時(shí) ,ATP、 mRNA和蛋白質(zhì)合成依舊 ,細(xì)胞第二信號(hào)系統(tǒng)仍活動(dòng) 。 ? *細(xì)胞壞死時(shí) ,細(xì)胞 DNA隨機(jī)降解 ,電泳不呈梯狀圖譜 。細(xì)胞凋亡時(shí) ,DNA多降解成 180～ 200bp或其倍數(shù)的梯狀片段 ,電泳呈梯狀圖譜 。 ? *細(xì)胞壞死時(shí) ,細(xì)胞內(nèi)容物外溢 ,引起局部炎癥反應(yīng)或組織損傷 。細(xì)胞凋亡時(shí) ,細(xì)胞內(nèi)容物不外溢 , 所以不引起炎癥反應(yīng)或局部損傷 。 ? *細(xì)胞壞死時(shí) ,往往是成團(tuán)細(xì)胞死亡 。細(xì)胞凋亡時(shí) ,在組織中呈分散狀態(tài)分布。 ?三 、 研究細(xì)胞凋亡的意義 ? 1. 細(xì)胞凋亡在腫瘤形成和治療中具有重要作用 。 ? *凋亡基因與抗凋亡基因突變 ? →→ 易形成腫瘤； ? *免疫效應(yīng)細(xì)胞表達(dá) FasL, ? 腫瘤細(xì)胞表達(dá) Fas→→ 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡 ? →→ 抗腫瘤 ? *腫瘤細(xì)胞高表達(dá) FasL→→ 誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡 ? →→ 抑制免疫功能 →→ 逃避免疫監(jiān)視 ? *腫瘤細(xì)胞低表達(dá)或不表達(dá) Fas ? →→ 逃避免疫監(jiān)視 ? 2. 細(xì)胞凋亡與免疫學(xué)的關(guān)系 ? *細(xì)胞凋亡與 T細(xì)胞在胸腺的發(fā)育 ? *細(xì)胞凋亡與成熟 T細(xì)胞： AICD ? *細(xì)胞凋亡與與 B細(xì)胞 ? *細(xì)胞凋亡與胞毒效應(yīng) ? ? ? *抗病毒免疫防御 ? *細(xì)胞凋亡與 AIDS ? *細(xì)胞凋亡與病毒性肝炎 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法 ? 一 、 形態(tài)學(xué)方法 ? 1． 普通光學(xué)顯微鏡檢測(cè)法 ? 2． 熒光顯微鏡檢測(cè)法 ? 材料： ① 石蠟切片 。② 冰凍切片 。③ 細(xì)胞學(xué)涂片 。 ? 方法一： ① PI染液：碘化丙啶 (propidium iodide,PI)； ② DAPI染液； ③ AO染液： ? *熒光顯微鏡下觀察 。 PI染色選用 600nm的激發(fā)光 ,DAPI選用 460～ 500nm的激發(fā)光 ,AO染色選用 520nm的激發(fā)光 。 ? * HE 染色核 DNA 呈藍(lán)色 , 而 PI 染色呈紅色 ,DAPI染色呈藍(lán)白色 ,AO染色呈黃綠色 。 凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)核濃縮 ,染色加深 ,或核染色質(zhì)呈新月形聚集于核膜一邊 。晚期凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為核碎裂成大小不等的圓形小體被細(xì)胞膜包繞 ,即凋亡小體 。 ?方法二： Hoechst 33342/PI雙標(biāo)記法 ? *在熒光顯微鏡下觀察 ， 凋亡細(xì)胞的藍(lán)色熒光比活細(xì)胞和非凋亡細(xì)胞都要強(qiáng) ，其光散射能力則降低 ， 將二者結(jié)合起來(lái) ，可以很好地鑒定凋亡細(xì)胞 。 壞死細(xì)胞則由于 PI復(fù)染 ， 呈紅色熒光 。 是目前細(xì)胞凋亡最滿意的形態(tài)學(xué)分析方法 。 ? *樣品來(lái)源 培養(yǎng)細(xì)胞或離體細(xì)胞制成的單個(gè)細(xì)胞懸液 。 ?方法三：碘化丙啶 （ PI） 和 Hoechst 33342(HO)雙染法 ? PI和 HO均可使用紫外光激發(fā) ， 其熒光分別為紅光和藍(lán)光 。 對(duì)照活細(xì)胞的 HO藍(lán)色熒光最強(qiáng) ， 而早期凋亡細(xì)胞由于其DNA降解和丟失 ， 其 HO藍(lán)色熒光較弱 ，也有很弱的 PI紅色熒光 。 晚期凋亡細(xì)胞PI紅色熒光增強(qiáng) ， 壞死細(xì)胞 PI紅色熒光最強(qiáng) ， 而 HO藍(lán)色熒光較弱 。 ? 3． 凋亡小體的電鏡觀察 小體系由細(xì)胞膜卷曲 、 脫落形成的小泡 ,其內(nèi)包含有完整的細(xì)胞器及核片段 。 ?二 、 生物化學(xué)方法 ? 電泳法 DNA梯帶 (DNA ladder)。 ?三 、 免疫學(xué)方法 (ELISA法 ) ? *細(xì)胞凋亡的發(fā)生 ,是由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活 ,核小體間區(qū)雙鏈 DNA解開 ,產(chǎn)生單 /低聚核小體片段 ,而核小體 DNA由于與組蛋白 H2A、 H2B、 H3和 H4形成緊密復(fù)合物而不被核酸內(nèi)切酶裂解 。 ?采用雙抗體夾心酶免疫法 ,應(yīng)用小鼠抗DNA和抗組蛋白的單克隆抗體 ,與核小體片段形成夾心結(jié)構(gòu) ,可特異性檢測(cè)細(xì)胞溶解物中的單 /低聚核小體。 ?四 、 原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù) (TdT或TUNEL) ? 凋亡細(xì)胞由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活 ,核DNA被切割成許多雙鏈 DNA片段以及高分子量DNA單鏈斷裂點(diǎn) (缺口 ),暴露出大量 339。羥基末端 ,如用 (TdT)將標(biāo)記的 dUTP進(jìn)行缺口末端標(biāo)記 ,則可原位特異地顯示出凋亡細(xì)胞 。 ? (一 )熒光標(biāo)記法 ? *采用美國(guó) Oncor公司 ApopTag TM 試劑盒 ，或德國(guó) Boehringer Mannheim公司 In Situ Cell Death Detection試劑盒 ? (二 )酶標(biāo)記法 ? *采用美國(guó) Oncor公司 ApopTagTMPeroxidase試劑盒
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