【正文】 酒、酒精消毒皮毛。（2）用解剖器械打開胸腔，取出胸腺，置含有4ml冷Hanks液的平皿內(nèi)。在200目不銹鋼網(wǎng)上，用5ml注射器針栓鈍性擠壓按摩，使胸腺細胞釋出，并經(jīng)不銹鋼網(wǎng)過濾。（3）將上述細胞懸液移如試管，1 000 r/min，離心10 min 。棄上清，沉積的胸腺細胞用冷Hanks液洗滌兩次后，記數(shù)并用Hanks液配成1107/ml淋巴細胞懸液。通常，1081108個細胞。2．細胞毒實驗（1）取4支試管，做好標記，按表44所示依次加入各成分。輕輕混勻后，置370C水浴30min。（2）每管加入1% ml，混勻，室溫靜置2 min 。（3）% ml，混勻，立即滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，迅速鏡檢（要求在5min內(nèi)鏡檢完畢）。 表44 補體介導的細胞毒試驗各管加入的成份和量（ml） 試驗材料實驗管補體對照管 細胞對照管抗體對照管1107/ml小鼠胸腺細胞抗Thy1單克隆抗體（適當稀釋度）Hanks1:3補體（經(jīng)胸腺細胞吸收） 混勻，置370C 水浴30 min1%伊紅Y染液混勻，置室溫2 min8% 戊二醛混勻，固定1 min【結(jié)果分析】于高倍鏡下計數(shù)200個細胞，計算死細胞的百分數(shù)。死細胞腫脹變大，呈暗紅色；活細胞形態(tài)正常，不著色，折光性強，有立體感?！咀⒁馐马棥?．因細胞活性直接影響試驗結(jié)果，故在處死動物前，要做好實驗準備工作，力求在盡可能短的時間內(nèi)制備好胸腺懸液，完成整個實驗。2．因有的豚鼠血清對小鼠淋巴細胞有天然毒性作用，故應(yīng)篩選活性高、毒性低的新鮮豚鼠血清作為補體，對獲滿意結(jié)果至關(guān)重要。3．抗T細胞單克隆抗體和補體的稀釋度，要按效價在預(yù)試驗中確定。4．實驗用品要潔凈，試劑配制要準確，避免各種可能的干擾因素影響試驗結(jié)果。5．觀察結(jié)果時，鏡檢操作要熟練、準確、快速，時間過長，著色細胞就會增多。附 HLA血清學分型法人類白細胞抗原（HLA）是由HLA復合體編碼的一組抗原，具有高度的多態(tài)性，HLA不論在基礎(chǔ)免疫學，還是臨床醫(yī)學方面，均具有重要的研究價值。HLA分型技術(shù)，已被廣泛用于器官和骨髓移植前供受者HLA配型、研究HLA與默寫疾病的相關(guān)性、法醫(yī)鑒定、親子鑒定，以及遺傳學研究等。HLA分型的方法，主要有血清學分型法、細胞學分型法和基因分型法等技術(shù)。HLA血清學分型法，是應(yīng)用一系列已知的抗HLA特異性標準分型血清（抗體）與待檢淋巴細胞混合，再加入一定量的補體進行孵育。若待檢淋巴細胞表面的HLA抗原與移植分型血清（抗體）一致，在補體作用下導致細胞毒作用。由于該分型試驗是在微量反應(yīng)板中進行，分型血清、淋巴細胞和補體用量少，故稱為補體歷來的微量細胞毒試驗。應(yīng)用血清學方法鑒定的抗原稱為SD抗原，包括HLAA、B、C、DR和DQ抗原?！净驹怼? 將待檢淋巴細胞加入含有各種已知抗HLA標準血清的微孔板（定型血清板）中，則淋巴細胞與相應(yīng)的抗HLA抗體結(jié)合，繼而在補體作用下發(fā)生細胞膜破壞、死亡。死亡細胞被染料著色。因此可根據(jù)死亡細胞的百分率，判定淋巴細胞表面HLA的型別?！酒鞑脑噭? 1．待檢淋巴細胞懸液 取待檢者抗凝血10ml，采用淋巴細胞分離液分離PBMC，洗滌后用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至2106/ml。如欲檢測HLADR、DQ抗原，需用富含B 細胞的懸液。2．HLA分型板市售標準HLA分型反應(yīng)板（Terasaki板），一般為72孔，從上至下分為112行，從左至右分為A、B、C、D、E、F 6列。隨分型板附有個孔包被的標準分型血清位置表，以表可知分型板各孔包被的為何標準血清，并表明了陽性和陰性對照位置。3．補體 采用家兔新鮮混合血清。4．試劑 5%伊紅Y水溶液、液體石蠟、12%中性甲醛（用1mol/L NaOH ）。5．器材 導致相差顯微鏡或普通光學顯微鏡、水平離心機、冰箱、微量移液器等?！痉椒ú襟E】1． 將凍存的含已知抗體的HLA血清板解凍，平衡至室溫。2． 每孔加2106/ml PBMC懸液1181。l,混勻后置室溫（220C）30 min。3． 每孔加兔補體5181。l，混勻后置室溫60min。4． 每孔加5%伊紅Y水溶液3181。l，混勻后置室溫3~5min。5． 每孔加12%中性甲醛溶液8181。l，固定，終止反應(yīng)。6． 靜置，待細胞下沉后用低倍鏡倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果?！窘Y(jié)果分析】在低倍倒置相差顯微鏡下，每孔計數(shù)100個細胞，并計算死細胞的百分率，判定標準及其意義見表45。表45 微量細胞毒試驗的判定標準死細胞（%） 計分 結(jié)果判斷死細胞（%） 計分 結(jié)果判斷010 1 陰性1120 2 微弱陽性2140 4 弱陽性 4180 6 陽性 81100 8 強陽性【注意事項】1．用于HLA分型的血液標本以玻璃珠脫纖維抗凝為好，詞法淋巴細胞獲得率高，血小板污染少，結(jié)果宜于觀察。2．選用的分型血清板所含標準抗血清種類應(yīng)覆蓋本地區(qū)或本民族80%以上的HLA抗原，其中每一項高頻抗原相應(yīng)的特異性抗體為3份以上，低頻抗原相應(yīng)特異性抗體為2份以上。3．使用的補體應(yīng)新鮮，活性高。且對淋巴細胞無天然毒性作用。補體的采集以20只以上家兔的血清混合為好，小量分裝，200C低溫或凍干保存。 實驗五 免疫標記技術(shù) 免疫技術(shù)是利用抗原抗體反應(yīng)進行的檢測方法，即應(yīng)用制備好的特異性抗原或抗體作為試劑，以檢測標本中的相應(yīng)抗體或抗原。它的特點是具有高度的特異性和敏感性。如將試劑抗原或試劑抗體用可以微量檢測的標記物（例如用熒光素、放射性同位素、酶、鐵蛋白、膠體金及化學或生物發(fā)光劑等）進行標記，則在與標本中的相應(yīng)抗體或抗原反應(yīng)后，可以不必測定抗原抗體復合物本身，而是測定復合物中的標記物，通過標記物的放大作用，進一步提高了免疫技術(shù)的敏感性，這就是免疫標記技術(shù)。它可借助熒光顯微鏡，射線測量儀，酶標檢測儀，電子顯微鏡和發(fā)光免疫測定儀等精密儀器，對實驗結(jié)果直接鏡檢觀察或進行自動化測定，可以在細胞、亞細胞、超微結(jié)構(gòu)及分子水平上，對抗原抗體反應(yīng)進行定性和定位研究；或應(yīng)用各種液相和固相免疫分析方法，對體液中的半抗原、抗原或抗體進行定性和定量測定。因此，免疫標記技術(shù)在敏感性、特異性、精確性及應(yīng)用范圍等方面遠遠超過一般免疫血清學方法。熒光免疫技術(shù)、酶免疫技術(shù)和放射免疫技術(shù)，即經(jīng)典的三大標記技術(shù)。 一 酶免疫技術(shù) 酶免疫技術(shù)（immunoenzymetic technique）是將抗原和抗體反應(yīng)的特異性和酶的高效催化反應(yīng)的專一性相結(jié)合而建立的一種新技術(shù)。酶與抗體或抗原結(jié)合后，既不改變抗體或抗原的免疫學反應(yīng)的~特異性，也不影響酶本身的酶學活性，即在相應(yīng)而合適的作用底物參與下，使基質(zhì)水解而顯色，或使供氫體由無色的還原型變?yōu)橛猩难趸汀＿@種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學顯微鏡和電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計加以測定。顯色反應(yīng)顯示了酶的存在，從而證明了相應(yīng)免疫反應(yīng)的發(fā)生。所以，這是一種特異而敏感的技術(shù)，可以在細胞或亞細胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平對其進行定量。酶免疫技術(shù)是目前主流的免疫學檢測技術(shù)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學和生物學科的各個領(lǐng)域。通過以下實驗，應(yīng)掌握各項實驗的基本原理。 （一）酶標抗體的制備【基本原理】 通過化學反應(yīng)或免疫反應(yīng)，使酶與抗體結(jié)合，其結(jié)合的產(chǎn)物為酶標抗體。本次實驗采用改良過碘酸鹽氧化法，以辣根過氧化物酶（HRP）標記抗體。HRP含有18％的碳水化合物，酶的糖鏈部分與酶的活性無關(guān)，用過碘酸鈉將酶表面糖分子的羥基氧化為醛基，醛基的化學性質(zhì)活潑，可與抗體分子的氨基結(jié)合，形成按克分子比例結(jié)合的酶標記物，然后用NaHB4還原即成酶標記的抗體?！酒鞑脑噭浚℉AC－NaAC）緩沖液； （CBS 包被液）；NaBH4（或KBH4）臨用時用蒸餾水配成1mg/；%乙二醇 （）；6；辣根過氧化物酶（HRP）； 待標記的抗體。【方法步驟】（改良過碘酸鹽氧化法）將HRP HAC－NaAC緩沖液中，滴入NaIO4 （此時酶的顏色應(yīng)由黃變綠），4℃作用30min。%（穩(wěn)定劑），室溫下30min。加入待標記的抗體5～10mg， ，4℃過夜。加入NaBH4（或KBH4），混勻，4℃作用2h，然后至透吸袋中， PBS透吸，4℃過夜（換液2～3次）。加適量中性甘油后小量分裝，置－20℃～－30℃保存?！窘Y(jié)果分析】用酶聯(lián)免疫吸附試驗對標記結(jié)果進行判定，必要時用標準酶標抗體進行對比分析。（參見酶聯(lián)免疫吸附試驗）【注意事項】該法可獲得高產(chǎn)量具有高度免疫活性和非特異性顯色低的標記物。70％的酶與抗體結(jié)合，99％的抗體被酶結(jié)合。如果需要可進一步對酶標抗體純化，以去除未結(jié)合的抗體。 （二）酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）【實驗原理】先將抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。當加入陽性標本（測定其中的抗體或抗原）后即與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)而結(jié)合到固相載體上。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質(zhì)分開，再加入酶標抗體或抗原，最后加入酶反應(yīng)的底物，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺來進行定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，可放大反應(yīng)的效果，從而使測定方法達到很高的敏感度?！酒鞑脑噭繕吮? 待檢血清，陰性對照血清，陽性對照血清。試劑（1）包被緩沖液（、）； （2）洗滌緩沖液（ PBS）；（3）稀釋液【％牛血清白蛋白（BSA）或使用以羊血清、兔血清等與洗滌液配成的5%—10%液】； （4）終止液（2 M H2SO4）； （5）底物緩沖液（pH ）；（6）TBM（四甲基聯(lián)苯胺）使用液；（7）ABTS顯色液；【注：ABTS,2,2’Azinobis(3ethylbenztbiozoline6sulfonic acid),即2，2’連氮基雙（3乙基苯并噻吡咯啉6磺酸）】。 器材（1）聚苯乙烯塑料板（簡板酶標板）40孔或96孔、ELISA檢測儀、50μl及100μl加樣器、塑料滴頭、小毛巾、洗滌瓶。（2）小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。（3）4℃冰箱、37℃孵育箱?！痉椒ú襟E】1．用于檢測未知抗原的雙體夾心法：圖5－1 雙體夾心法原理示意圖 （1）包被：用pH 、（包被緩沖液）將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1mg/L～10mg/L。，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3min。（簡稱洗滌，下同）。（2）加樣：，置37℃孵育1h。然后洗滌。同時做空白孔、陰性對照孔、陽性對照孔。（3）加酶標抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）。37℃～1h，洗滌。（4）加底物液顯色：，37℃10～30min。（5）終止反應(yīng)：。（6）結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強；陰性反應(yīng)為無色或極淺。依據(jù)所呈顏色的深淺，以“＋”、“－”號表示。也可測OD值：ELISA讀數(shù)儀上，于波長450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，即為陽性。2．用于檢測未知抗體的間接法：圖5－2 間接法原理示意圖 （1）用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1mg/L～1０mg／Ｌ，4℃過夜。次日洗滌3次。（2）加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體），置37℃孵育1h，洗滌。同時做空白、陰性及陽性孔對照。（3）在反應(yīng)孔中加入新鮮稀釋的酶標第二抗體（抗抗體），37℃孵育30～60imn，洗滌，最后一遍用洗滌液或蒸餾水洗滌。（4）其余步驟同“雙抗體夾心法”的6。【結(jié)果分析】1．肉眼判定 明顯顯色者判為陽性，否則判為陰性。2．酶標儀判定 采用反應(yīng)底物的最大吸收波長測定OD值。本實驗底物為TMB，最大吸收波長為450nm，因此，應(yīng)測定OD450值?！咀⒁馐马棥空綄嶒灂r，應(yīng)分別以陽性對照與陰性對照控制實驗條件，待檢樣品應(yīng)作一式兩份，以保證實驗結(jié)果的準確性。有時本底較高，說明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。在ELISA中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括：（1）固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙稀、聚苯乙稀、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。（2）包被抗體（或抗原）的選擇：將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時，要求純度好，～。吸附溫度、時間及其蛋白量也有一定影響，一般多采用4℃18～24h。蛋白質(zhì)包被的最適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度（、）進行包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本的吸光度OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為（1～10mg/L）。（3）酶標記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定，然后再固定其它條件或采取“方陣法”（包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度），在正式實驗系統(tǒng)里準確地滴定其工作濃度。（4）酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌