克隆載體與表達(dá)載體-資料下載頁(yè)
2025-08-05 03:01本頁(yè)面
【正文】 為36kb.首先構(gòu)建一個(gè)含多克隆位點(diǎn)和篩選標(biāo)志的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有病毒基因組某段早期序列；然后將一個(gè)含有啟動(dòng)子一外源基因poly A的表達(dá)盒插入到上述質(zhì)粒中腺病毒EE3或E4至右側(cè)的ITR區(qū)之間，構(gòu)建成載有外源基因的穿梭質(zhì)粒。反轉(zhuǎn)錄病毒載體泡沫病毒類從5’端開始依次是：①5’長(zhǎng)末端重復(fù)序列(5’LTR)，帶有增強(qiáng)子和啟動(dòng)子序列；②psi序列，又稱ψ序列，是病毒包裝所必須的信號(hào)序列；③gag，編碼病毒衣殼蛋白；④pol，編碼反轉(zhuǎn)錄酶和整合酶(Int)；⑤env，編碼病毒顆粒外層包裝蛋白；⑥3’長(zhǎng)末端重復(fù)序列(3’LTR)，帶有poly A加尾信號(hào)序列。一類含單鏈RNA的動(dòng)物病毒。它的基因組含有2條相同的正鏈RNA分子，包裝成二倍體病毒顆粒。（1）在大多數(shù)情況下，反轉(zhuǎn)錄病毒的腫瘤基因(onc)都能夠在正常的細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。 2）反轉(zhuǎn)錄病毒的寄主范圍相當(dāng)廣，包括無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物。3）反轉(zhuǎn)錄病毒具有強(qiáng)啟動(dòng)子，外源基因可得到有效表達(dá)。4）反轉(zhuǎn)錄病毒不但感染效率高，而且不招致寄主細(xì)胞的死亡載體的構(gòu)建:分離原病毒DNA→刪去部分序列→組入選擇性標(biāo)記基因、目的基因和調(diào)控元件→克隆到含有大腸桿菌復(fù)制起始位點(diǎn)的克隆載體→轉(zhuǎn)化大腸桿菌→獲得反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體→ 輔助細(xì)胞系(包裝細(xì)胞系) →擴(kuò)增慢病毒類致癌病毒類SV40病毒型轉(zhuǎn)化載體根據(jù)SV40 DNA進(jìn)入敏感動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)方向，分為早期轉(zhuǎn)錄區(qū)和晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)。早期轉(zhuǎn)錄區(qū)包括與病毒感染相關(guān)的t抗原基因(small Tantigen)和T抗原基因(large Tantigen)等；含有BamHI等限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)；晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)包括與病毒殼蛋白合成相關(guān)的基因，含有EcoRi等限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)。①含有能夠被真核細(xì)胞識(shí)別的有效的啟動(dòng)子。②有許多種動(dòng)物病毒，在其感染周期中都能夠持續(xù)地復(fù)制，使其基因組拷貝數(shù)達(dá)到相當(dāng)高的水平。③有些動(dòng)物病毒具有控制自己復(fù)制的順式元件和反式作用因子。④有些動(dòng)物病毒，在它們的復(fù)制過(guò)程中能高效穩(wěn)定地整合到寄主核基因組上。⑤病毒的外殼蛋白質(zhì)能夠識(shí)別細(xì)胞接受器。用病毒外殼蛋白質(zhì)包裝重組質(zhì)粒DNA形成的假病毒顆粒，即構(gòu)成了一種高效的轉(zhuǎn)化體系猿猴空泡病毒40(Simian vacuolating virus 40, SV40)基因組是一種環(huán)形雙鏈的DNA，其大小僅有5243bp，很適于基因操作。導(dǎo)致人體癌變的可能性極低，對(duì)人體是安全的。一些質(zhì)粒型表達(dá)載體帶有來(lái)自SV40DNA的個(gè)別調(diào)控區(qū)，位于病毒的早期與晚期轉(zhuǎn)錄單位之間，包括DNA復(fù)制起始位點(diǎn)早期與晚期mRNA轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)能激活復(fù)制起始位點(diǎn)并可自動(dòng)調(diào)節(jié)早期轉(zhuǎn)錄的T抗原結(jié)合位點(diǎn)可被細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別的一般由3個(gè)G/C豐富的21bp同向復(fù)制區(qū)組成的序列組成SV40早期增強(qiáng)子的2段72bp同向重復(fù)序列。大片段表達(dá)載體 TAC可轉(zhuǎn)移人工載體結(jié)合了PAC和雙元載體的優(yōu)點(diǎn)：具有多克隆位點(diǎn)，具有P1復(fù)制子和RI質(zhì)粒復(fù)制子能在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中以單拷貝的形式穿梭復(fù)制。其TDNA右邊界處插入了植物選擇標(biāo)記潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hpt）和Pnos啟動(dòng)子。在TAC載體中重組篩選標(biāo)記是卡那霉素抗性基因和sacB基因應(yīng)用TAC載體在獲得目的克隆后可不必進(jìn)行煩瑣的亞克隆，而可直接進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化并開展功能互補(bǔ)分析，可大大促進(jìn)功能基因的精細(xì)定位和圖位克隆。TAC載體具有克隆大片段DNA和借助于農(nóng)桿菌直接轉(zhuǎn)化植物的功能。TAC還具有以下優(yōu)越性：①可通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)直接進(jìn)行基因功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。TAC載體中具有P1裂解子，可以在IPTG的誘導(dǎo)下產(chǎn)生520個(gè)拷貝，提高了質(zhì)粒產(chǎn)量。MAC哺乳動(dòng)物人工染色體?、?外源DNA片段的容量大；②不整合到宿主染色體上，不會(huì)破壞宿主基因組的結(jié)合和功能，可以穩(wěn)定地存在；③較少發(fā)生基因沉默現(xiàn)象MAC構(gòu)建的理論基礎(chǔ)在于將哺乳動(dòng)物染色體復(fù)制起始位點(diǎn)序列、端粒和著絲點(diǎn)分離出來(lái)，然后和一些載體元件組合構(gòu)成人工染色體，可以將外源基因及其調(diào)控序列引入哺乳動(dòng)物。它與宿主細(xì)胞內(nèi)的染色體一樣穩(wěn)定，但并不整合人宿主基因組。
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