t載體與目的基因連接-資料下載頁(yè)
2025-08-16 23:57本頁(yè)面
【正文】 方法一：快速PCR篩選法 ?。?） 在轉(zhuǎn)化的平板培養(yǎng)基上隨機(jī)選取4個(gè)邊緣清晰的白色菌落，并用記號(hào)筆在其所在的培養(yǎng)皿底部玻璃背面畫(huà)圈做標(biāo)記編號(hào)。 （2） PCR 微量離心管中配制25μl反應(yīng)體系。 dd water 16μl 10PCR buffer（不含MgCl2） 25mM MgCl2 ?。ǎ? 10μmol/L Primer1 1μl（—25pmoles） 10μmol/L primer2 1μl（—25pmoles） 模板質(zhì)粒 用小tip頭輕輕粘一下選中的白色菌落，再伸入PCR混合液中洗一洗 Taq酶 （） 總體積 25μl ?。?）根據(jù)廠商的操作手冊(cè)設(shè)置PCR儀的循環(huán)程序（本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)設(shè)置為WZ）： ① 94℃5min ②94℃1min ③60℃1min ④72℃1min50s⑤goto②29 times ⑥72℃10min ?。?） PCR結(jié)束后，取10μl產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（與原始插入片斷同時(shí)比對(duì)）。觀察膠上是否有預(yù)計(jì)的主要產(chǎn)物帶。 ?。?） 按照編號(hào)找到培養(yǎng)皿中的原菌斑。根據(jù)需要進(jìn)行放大培養(yǎng)提取其質(zhì)粒 ?。?） 提取到的質(zhì)粒與原先的空載體（或已知分子量的質(zhì)粒）再對(duì)比電泳，以進(jìn)一步確認(rèn)。 方法二：提質(zhì)粒再PCR或酶切鑒定 （1）在超凈工作臺(tái)中取3支無(wú)菌搖菌管，各加入3mL LB（含50mg/mL氨芐青霉素），用記號(hào)筆寫(xiě)好編號(hào)。 ?。?）在超凈工作臺(tái)中將70%乙醇浸泡的小鑷子頭用酒精燈烤過(guò)，鑷取一支無(wú)菌牙簽。用牙簽的尖部接觸轉(zhuǎn)化的平板培養(yǎng)基 上的一個(gè)白色菌落，然后將牙簽放入盛有3mL LB（含50mg/mL氨芐青霉素）的搖菌管中。用此法隨機(jī)取3個(gè)白色菌落，分別裝入3個(gè)搖菌管中。 ?。?）37℃搖菌過(guò)夜后，用堿裂解法分別提取質(zhì)粒。搖菌管中的剩余菌液保留在4℃冰箱中。 ?。?）提取到的3管質(zhì)粒樣品可用PCR法擴(kuò)增，或用酶切電泳法來(lái)鑒定其上是否含有外源插入片斷（方法見(jiàn)有關(guān)實(shí)驗(yàn)）。 ?。?）將經(jīng)過(guò)鑒定判斷為正確的質(zhì)粒保存。按照編號(hào)找到冰箱中原菌液。根據(jù)需要進(jìn)行放大培養(yǎng)提取其質(zhì)?；蜻M(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，或取500mL菌液與500mL 65%甘油混合后80℃保存。 ?。?）在被細(xì)菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面
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