【正文】 結(jié)果與分析 pBI121質(zhì)粒提取結(jié)果 質(zhì)粒提取瓊脂糖凝膠電泳圖從上圖可以看出，質(zhì)粒提取液中無(wú)蛋白污染，對(duì)其進(jìn)行濃度檢測(cè)其濃度約為200ng/ μL。 雙酶切圖譜 雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖、BamHIHF內(nèi)切酶對(duì)pBI121載體進(jìn)行雙酶切的GUS基因，膠回收可得到無(wú)GUS 的pBI121線性化載體。第4章 CPC5基因表達(dá)載體的構(gòu)建 Infusion酶技術(shù)連接的原理Infusion引物的設(shè)計(jì)原則：在連接前將原來(lái)的基因引物前面，按照下列要求加15bp的重疊序列 Infusion引物的設(shè)計(jì)例圖 Infusion酶技術(shù)連接的具體操作(1)infsion連接前處理：將10 μL 目的基因PCR產(chǎn)物和4 μL enhancer混勻在37℃靜置15min，80℃15min。(2)連接：將含有15bp重疊區(qū)的基因和pBI121載體，按照片段數(shù)3:1 的比例[27] 袁英歌, 郭傳宇, [J]．石河子大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2011,29(4):398400.進(jìn)行加入。 基因與載體的連接體系試劑名稱(chēng)試劑用量5X InFusion HD Enzyme Premix2 μL線性化載體6 μLGhCPC5基因(用infusion引物獲得)1 μL加水至10 μL(3)將上述溶液混勻，50℃靜置15 min，然后放在冰上，進(jìn)行轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，涂板過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單克隆，測(cè)序。該過(guò)程用的平板為含卡那霉素的LB培養(yǎng)基，配制的卡那霉素為50mg/mL，用時(shí)稀釋1000倍，即100 mL的培養(yǎng)基加入100 uL的50 mg/mL卡那霉素。 引物的5’末端必須包含與載體末端相同的15個(gè)堿基序列,引物的3’末端必須包含與目的基因片段相互補(bǔ)的特異堿基序列 質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)農(nóng)桿菌為中棉所所保存，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化步驟(凍融法)如下：第5章 表達(dá)載體的PCR菌落鑒定 PCR菌落鑒定的原理菌落PCR鑒定是直接以菌體熱解后暴露的DNA為模板，使用載體上的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。此法可不必提取基因組DNA，不必酶切鑒定。通常利用此方法進(jìn)行重組體的篩選或者DNA測(cè)序分析。最后的PCR產(chǎn)物大小是載體通用引物之間的插入片斷大小[28] 王關(guān), 方宏筠, 植物基因工程[M].北京：科學(xué)出版社,2002,33:776777.。菌落PCR與我們通常的普通DNA的PCR的不同在于，直接以單個(gè)菌作為模板。是一種可以快速鑒定菌落是否為含目的質(zhì)粒的陽(yáng)性菌落。操作簡(jiǎn)單，快捷，陽(yáng)性率較高，在轉(zhuǎn)化鑒定中較常見(jiàn)。 感受態(tài)細(xì)胞的制定(1)將大腸桿菌DH5α貯存菌液在無(wú)抗的LB平板劃線，37℃過(guò)夜培養(yǎng)；(2)從37176。C過(guò)夜(1620 hours)培養(yǎng)平皿內(nèi)挑取單菌落。把這樣的單菌落接種于一只裝有5毫升LB 的30毫升滅菌試管中，于37176。C下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。(3)按1%(v/v)接入新鮮的LB液體培養(yǎng)基。取2mL接種于200 mL LB培養(yǎng)基中，37176。(此時(shí)細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)。(4)將菌液加入事先預(yù)冷的無(wú)菌離心管中，冰上放置10 min后，4℃，4000 rpm，離心10min收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞。(5)棄上清，再將菌體懸浮于1/10體積(20 mL)的無(wú)菌、預(yù)冷的終濃度為20 mmoL/L的CaCL2和80 mmoL/L的MgCL2溶液中，4℃，3,500 rpm，離心10min；(6)棄上清， moL/L的無(wú)菌CaCL2溶液中，即為感受態(tài)細(xì)胞；(7) mL的Eppendorf管中，200 μL/支，加入無(wú)菌甘油，使甘油最終含量達(dá)到1520%，液氮速凍后，于80℃冰箱中凍存，備用。 將基因片段轉(zhuǎn)入到感受態(tài)細(xì)胞中轉(zhuǎn)化步驟如下：(1)取出感受態(tài)，冰上放置，加入已連接的質(zhì)粒DNA(一般含量是10微升或更低的體積中所含量應(yīng)不超過(guò)50納克)[29] 王鏡巖, 朱圣庚, (下)[M].北京：高等教育出版社,2002,26:581584.，細(xì)心混勻管中成份。于冰浴放置30到40分鐘。(2)把轉(zhuǎn)化管轉(zhuǎn)移至放于42176。C循環(huán)水浴鍋中預(yù)熱的試管架上，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)90秒。(此時(shí)不能搖動(dòng)轉(zhuǎn)化管)(3)把EP管迅速轉(zhuǎn)移至冰上，冰浴23分鐘。(4)向每只試管中加入500微升LB液體培養(yǎng)基。37176。C振蕩培養(yǎng)4560分鐘，以使細(xì)菌復(fù)蘇，并容許質(zhì)粒所編碼的抗生素抗性的表達(dá)。(5)轉(zhuǎn)移適量體積(如果使用90毫米平板，一半涂布量不應(yīng)超過(guò)100微升)的經(jīng)轉(zhuǎn)化處理的感受態(tài)細(xì)胞涂布于含有相應(yīng)抗生素的LB瓊脂平板上[30] 陳前武, 郭鎂渼, [J].,37(18):2325。(6)室溫放置平板直到其上液體被吸收。(7)于37176。C倒置平板培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化克隆應(yīng)該于1216 小時(shí)區(qū)間出現(xiàn)。 菌落PCR并電泳檢測(cè)將已經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞涂布在LB固體平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)。一段時(shí)間以后，常溫下隨機(jī)挑選轉(zhuǎn)化板上的轉(zhuǎn)化子，用滅菌的牙簽或槍頭挑取單個(gè)菌落(強(qiáng)調(diào)單個(gè)，不能是雙克隆)，在LB瓊脂糖平板上輕點(diǎn)，做一拷貝；然后將沾有菌體的牙簽或槍頭置于相應(yīng)的裝有PCR管中或者96孔PCR反應(yīng)進(jìn)行反應(yīng)。 PCR反應(yīng)體系為25 μL的體系試劑試劑使用量5(Mg2+ pLus)5 μLdNTP Mixture()2 μLPrimer 11 μLPrimer 21 μL模板DNA 2 μLPrimeSTAR HS DNA PoLymerase () μLddH2OUp to 25 μLPCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 3 min；(94℃ 30 s；58℃ 30 s；72℃ 2 min)30；72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后4℃保存。將擴(kuò)增出來(lái)的反應(yīng)液中加入溴酚藍(lán)或是其他染料，電泳檢測(cè)是否得到目的片斷。 結(jié)論與分析: CPC5基因的菌落PCR鑒定和目的基因片段大小一致對(duì)應(yīng)的菌液進(jìn)行測(cè)序，菌液的培養(yǎng)時(shí)間不宜太長(zhǎng)時(shí)間，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致菌液老化，不容易測(cè)序及菌液的保存。結(jié) 論本研究采用獲得目的基因的方法是根據(jù)已知的基因序列通過(guò)設(shè)計(jì)引物，特異性地分別擴(kuò)增出目的基因片段。獲取模板DNA采用的是利用ETAB法提取基因組DNA，此法提取的目的基因組DNA純度較高，可用于作為擴(kuò)增模板，特異性地?cái)U(kuò)增基因片段。選擇的載體為在棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)中常用的pBI121質(zhì)粒載體，此載體大小為8196bp，酶切位點(diǎn)比較少但較易導(dǎo)入棉花中，也較易導(dǎo)入擬南芥中。為了克服pBI121質(zhì)粒載體酶切位點(diǎn)比較少這一缺陷，本研究采用的是Infusion酶連接技術(shù)。此技術(shù)利用的是同源重組，交換連接的方式，可以一次性連接兩個(gè)或兩個(gè)以上的不同大小的基因片段致 謝本論文是在安陽(yáng)工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院孫九光老師的悉心指導(dǎo)下完成的。孫老師作為一名優(yōu)秀的、經(jīng)驗(yàn)豐富的教師，具有豐富的生物學(xué)知識(shí)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，在整個(gè)論文實(shí)驗(yàn)和論文寫(xiě)作過(guò)程中，對(duì)我進(jìn)行了耐心的指導(dǎo)和幫助，提出嚴(yán)格要求，引導(dǎo)我不斷開(kāi)闊思路，為我答疑解惑，鼓勵(lì)我大膽創(chuàng)新，使我在這一段寶貴的時(shí)光中，既增長(zhǎng)了知識(shí)、開(kāi)闊了視野、鍛煉了心態(tài)，又培養(yǎng)了良好的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣和科研精神。在此，我向我的指導(dǎo)老師表示最誠(chéng)摯的謝意！在論文即將完成之際，我的心情久久無(wú)法平靜，從開(kāi)始選題到順利論文完成，有不知多少多少可敬的師長(zhǎng)、同學(xué)、朋友給了我無(wú)數(shù)的幫助。感謝中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所提供的實(shí)驗(yàn)器材和實(shí)驗(yàn)藥品，感謝纖維能源課題全體師生給予我豐富的專(zhuān)業(yè)知識(shí)和各個(gè)方面的關(guān)心和幫助，感謝師兄師姐的認(rèn)真負(fù)責(zé)，感謝合作組員的熱心協(xié)助。同時(shí)也要感謝09級(jí)生物技術(shù)班全體同學(xué)，正是由于你們的幫助和支持，我才能一個(gè)一個(gè)克服困難、解明疑惑，直至本文順利完成，在這里請(qǐng)接受我誠(chéng)摯的謝意！最后我還要感謝培養(yǎng)我長(zhǎng)大含辛茹苦的父母，謝謝你們！。結(jié)果表明此技術(shù)很成功地分別連接上了CPC5這個(gè)基因片段。這個(gè)質(zhì)粒載體的構(gòu)建，為下一步進(jìn)行棉花轉(zhuǎn)基因做準(zhǔn)備，為擬南芥花絮侵染分析MYB轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在棉花纖維細(xì)胞發(fā)育和擬南芥表皮毛的發(fā)育奠定基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)