原核生物分子克隆的宿主和載體系統(tǒng)-資料下載頁(yè)
2025-01-13 14:41本頁(yè)面
【正文】 性末端 54 dATP dTTP 55 ?PCR產(chǎn)物的克隆連接 ?PCR反應(yīng)中所使用的聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移酶的活性，通常在 3’ 末端加上 A。 ? 經(jīng)特使處理的載體具有 3’ 突出 T堿基，通過(guò) T/A互補(bǔ)，進(jìn)行克隆。屬于黏性末端的連接，該克隆方式特稱(chēng) TA克隆。 56 從生物秀網(wǎng)站下載 57 二、定向克隆 ?將外源 DNA按正確的方向插入載體。通常采用不同的內(nèi)切酶分別處理載體和片段，使線(xiàn)性載體和片段的兩段帶有不同的粘性末端，通過(guò)載體與片段之間的連接，實(shí)現(xiàn)定向克隆。 58 第五節(jié) ：一個(gè)基因在 E. coli 中的調(diào)節(jié)表達(dá) 59 一、研究目的 ? 研究擬南芥中鈣結(jié)合蛋白 —— 肌鈣網(wǎng)蛋白在花中的功能。 ? 需制備該蛋白的抗體 60 二、研究基礎(chǔ) ? 獲得了基因的 cDNA克隆 ? 獲得了原核表達(dá)載體和細(xì)菌菌株 ? 獲得了純化蛋白質(zhì)用的金屬螯合層析柱 ? 具備免疫家兔的實(shí)驗(yàn)技術(shù) 61 三、研究策略 ? 構(gòu)建原核表達(dá)載體 ? 純化蛋白 ?免疫家兔 ?檢測(cè)該蛋白質(zhì)在花中的表達(dá) 62 將外源片段與載體用相同的內(nèi)切酶處理后，連接，形成重組分子，構(gòu)建表達(dá)載體 如何構(gòu)建載體？ 63 ?原核表達(dá)載體 pET系統(tǒng)能夠表達(dá)外源基因的原理 （ a） 分別利用 T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄目標(biāo)基因，用大腸桿菌自身的系統(tǒng)翻譯合成目標(biāo)蛋白質(zhì)。 （ b）需要大腸桿菌能表達(dá) T7 RNA聚合酶 （ c）加入誘導(dǎo)物（ IPTG，異丙基 β D硫代半乳糖苷 ）同時(shí)開(kāi)啟 T7 RNA聚合酶和目標(biāo)基因的表達(dá)。 （ d）對(duì) SD序列與 AUG之間的距離進(jìn)行了優(yōu)化 64 lac O T7 gene 1 lac promoter , RNA 聚合酶 lac I gene lac I repressor IPTG 誘導(dǎo) Host cell T7 RNA 聚合酶 lac O T7 promoter target gene lac I gene lac I repressor pET T7 RNA polimerase IPTG induction 克隆到 pET載體中的基因表達(dá)調(diào)控策略 65 lac O T7 gene 1 lac promoter , RNA polimerase lac I gene lac I repressor IPTG induction Host cell T7 RNA polimerase lac O T7 promoter target gene lac I gene lac I repressor pET T7 RNA polimerase IPTG induction pLysS Or E T7 lysozme gene T7 lysozme inactive 克隆到 pET載體中的基因表達(dá)調(diào)控策略 控制T7 RNA聚合酶本底表達(dá) 66 lac O T7 gene 1 lac promoter , RNA polimerase lac I gene lac I repressor IPTG induction Host cell T7 RNA polimerase lac O T7 promoter target gene lac I gene lac I repressor pET T7 RNA polimerase IPTG induction pLysS Or E T7 lysozme gene T7 lysozme inactive 克隆到 pET載體中的基因表達(dá)調(diào)控策略 控制T7 RNA聚合酶本底表達(dá) 67 (1) (2) (3) A B Sample Washing Elution X B Ligand containing Ni X B A A ?誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)后，用裂解液將細(xì)菌裂解，釋放蛋白。 ?將裂解液過(guò)一個(gè)鎳柱 ?將污染的蛋白洗滌后，將目標(biāo)蛋白洗脫 68 69
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