原核生物分子克隆的宿主和載體系統(tǒng)(完整版)
【正文】 TcR 3 4 ColE1 5 6 6 pBR313 ApRTcR pBR322 ApR TcR 7 8 pMB1 (b) 五、基于大腸桿菌的克隆載體 第一個(gè)人工構(gòu)建的遺傳載體 23 改進(jìn)了的載體（ pUC載體 — 乳糖選擇質(zhì)粒） ? 具有更高的拷貝數(shù) ? 重組體的識(shí)別只需要一步 ? 擁有更多的多克隆單酶切位點(diǎn) 五、基于大腸桿菌的克隆載體 24 pUC載體 — 乳糖選擇質(zhì)粒 ? (1)來(lái)自 pBR322質(zhì)粒的 復(fù)制起點(diǎn) (ori)； ? (2)氨卞青霉素 抗性基因 (AmpR)，但它的 DNA核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不再含有原來(lái)的限制酶的單識(shí)別位點(diǎn)； ? (3)大腸桿菌 β 半乳糖苷酶 (lacZ)的啟動(dòng)子及其編碼該基因氨基端 α 肽鏈的 DNA序列 ,此結(jié)構(gòu)特稱為 lacZ’ 基因 ； ? (4)多克隆位點(diǎn) (MCS)區(qū)段 ：位于 lacZ 基因中的靠近 5’ 端，內(nèi)含十幾個(gè)單一的限制性內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn)，使含有不同粘端的目的 DNA片段可方便地定向插入載體中。 ? 如果質(zhì)?？截悢?shù)高， RepA蛋白與自身的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄， RepA蛋白合成受阻， DNA的復(fù)制受到抑制。 三、調(diào)節(jié)拷貝數(shù)的機(jī)理 (質(zhì)粒的復(fù)制，補(bǔ)充知識(shí) ) 12 B、 如果 RNA I和 RNA II形成雙鏈 RNA螺旋， RNA酶 H不能降解 RNA II，復(fù)制不能進(jìn)行。 6 a互補(bǔ)顯色反應(yīng)（藍(lán)白斑篩選） lacZ β半乳糖苷酶 分解半乳糖 i P O 調(diào)控蛋白 α肽段 分解 Xgal 產(chǎn)物呈現(xiàn)藍(lán)色 誘導(dǎo)劑IPTG β半乳糖苷酶基因 lacZ突變體 M15 7 a互補(bǔ)顯色反應(yīng)（藍(lán)白斑篩選）總結(jié) 細(xì)菌菌株 野生型 突變體 （ Lac Z基因） 突變體 +無(wú)外源片段插入質(zhì)粒 （ Lac Z+ Lac Z’ ） 突變體 +有外源片段插入質(zhì)粒 （ Lac Z） Lac Z 蛋白 有 無(wú)（僅有 ω片段） 有（ ω +α 片段） 無(wú)（僅有 ω片段） 底物 Xgal分解情況 藍(lán)色菌落 白色菌落 藍(lán)色菌落 白色菌落 抗生素抗性 無(wú) 無(wú) 有 有 8 第二節(jié) 質(zhì)粒載體 一、質(zhì)粒的基本生物學(xué)特征 ? 質(zhì)粒是染色體外穩(wěn)定遺傳的復(fù)制體，其特點(diǎn)共價(jià)閉環(huán)，雙鏈 DNA分子。顯性質(zhì)粒與隱性質(zhì)粒 . 第二節(jié) 質(zhì)粒載體 10 二、質(zhì)粒的大小和拷貝數(shù) ? 相對(duì)分子量從 1kb到 250kb不等。 15 (2)關(guān)鍵蛋白與重復(fù)區(qū)域結(jié)合進(jìn)行調(diào)控的機(jī)理 B、復(fù)制原點(diǎn)附近有一個(gè)編碼基因 repA,編碼 RepA蛋白。這樣的兩種質(zhì)粒稱為不親和質(zhì)粒 19 第二節(jié) 質(zhì)粒載體 ? 引起質(zhì)粒的不相容的機(jī)理 A 具有相同的復(fù)制調(diào)控機(jī)制 B 控制質(zhì)粒分配的 par元件相同 ,也會(huì)引起質(zhì)粒的不相容 ? 不相容群：指那些具有不相容性的質(zhì)粒組成的一個(gè)群體，一般具有相同的復(fù)制子ColE1/pMB1 20 五、基于大腸桿菌的克隆載體 ? 克隆載體：是一種能攜帶外源 DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞中得到維持或表達(dá)的 DNA分子。 作用：進(jìn)入細(xì)胞的 λDNA 通過(guò)兩端的黏性末端環(huán)化。在此處插入外源基因，可表達(dá)β 半乳糖苷酶的融合蛋白 ，利用特異性抗體或DNA測(cè)序方法可 篩選重組 DNA。只要酶切割 DNA后產(chǎn)生單鏈突出（ 5‘ 突出及 3’ 突出）的粘性末端，同時(shí)酶切位點(diǎn)附近的DNA序列不影響連接，那么，當(dāng)這樣的兩個(gè) DNA片段一起退火時(shí)，粘性末端單鏈間進(jìn)行堿基配對(duì)，然后在 DNA連接酶催化作用下形成共價(jià)結(jié)合的重組 DNA分子。 ? 經(jīng)特使處理的載體具有 3’ 突出 T堿基，通過(guò) T/A互補(bǔ)，進(jìn)行克隆。 ?將裂解液過(guò)一個(gè)鎳柱 ?將污染的蛋白洗滌后，將目標(biāo)蛋白洗脫 68 69 。 56 從生物秀網(wǎng)站下載 57 二、定向克隆 ?將外源 DNA按正確的方向插入載體。原則上講，限制酶切割 DNA后產(chǎn)生的平端也屬配伍末端，可彼
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