第四節(jié)細(xì)菌和鏈霉菌的分子克隆載體-資料下載頁
2025-08-01 13:36本頁面
【正文】 酵母菌人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC)廣泛用于構(gòu)建高等動(dòng)植物基因組文庫的構(gòu)建 , 由 YLp經(jīng)適當(dāng)改造后構(gòu)建成 pYAC載體。 pYAC載體具有以下特點(diǎn)： 1） 雙 TEL位點(diǎn)； 2） 三個(gè)酵母菌遺傳標(biāo)記基因； 3） 一個(gè) SUP4基因用于檢測(cè)重組子 ，其原理是： SUP4是 tRNAtyr的赭色抑制突變基因，但把該基因轉(zhuǎn)入酵母菌的ade2赭色突變體時(shí)，宿主菌為白色菌落，要是在 SUP4基因中插入外源 DNA片段后在轉(zhuǎn)化 ade2宿主菌，轉(zhuǎn)化子成紅色菌落。 A m prTELTELS u p 4C E N 4 A R S 1T R P 1Or ip Y A C4E S m S X B X B p Y A C Or iT RP1TELTELHIS4AmprARSCENpYAC載體的結(jié)構(gòu) 9. 酵母雜交系統(tǒng)載體 主要用于研究 DNA蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)之間的相互作用，可用于新基因的克隆。該類載體可分為兩類： 一類載體中存在一個(gè) DNA結(jié)合序列 (BD)，它與已知的釣餌序列融合；另一類載體則含有基因表達(dá)激活序列（ AD），它則與未知或已知的捕獵序列融合。 單雜交系統(tǒng)載體 雙雜交系統(tǒng)載體 三雜交系統(tǒng)載體 除上述普通型的各類載體外，還有其它不同功能的載體： 表達(dá)型 — yeast expression plasmid。 啟動(dòng)子探針型 — yeast promoter plasmid, YPp。 雜合型 — yeast hybrid plasmid, YHp,與閱讀框架探針型相同。 N o n i n t e r c t i n g p r o t e i n sAD B a i tP r o t e i nD N A B DL i b r a r yP r o t e i nO p e r a t o r s o r u p s t r e a ma c t i v a t i n g s e q u e n c e sP r o m o t e rR e p o r t e r g e n e ( s )I n t e r a c t i n g p r o t e i n s a c t i v a t e t r a n s c r i p t i o n o f r e p o r t e rAD B a i tP r o t e i nL i b r a r yP r o t e i nD N A B DO p e r a t o r s o r u p s t r e a ma c t i v a t i n g s e q u e n c e sP r o m o t e r R e p o r t e r g e n e ( s )t r a n s c r i p t i o nF i g u r e 1 . S c h e m a t i c d i a g r a m o f t h e b a s i c f o u n d a t i o n o f t h e M A T C H M A K E R s y s t e m s .p U C o r iADM C SE c o R IX h o IT R P 1p B 4 2 A D 6 . 4 5 k bA m prPG A L 1TADH12 μOri雙雜交系統(tǒng)和載體 二、絲狀真菌克隆載體 1） 屬低等真核生物，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易于培養(yǎng) 2） 基因結(jié)構(gòu)與高等真核生物的基因結(jié)構(gòu)具較大相似性，如內(nèi)含子數(shù)目、位置等 3） 用于生產(chǎn)某些具生物活性的基因產(chǎn)物更具吸引力，如糖基化、蛋白質(zhì)外泌 4） 有些絲狀真菌的的遺傳背景較為清楚 2. 絲狀真菌克隆載體 1） 自主復(fù)制載體 ，其復(fù)制起點(diǎn)來源于以下三類 DNA： i. 線粒體質(zhì)粒，如來自間型脈孢菌 ()線粒體質(zhì)粒 : pBR322+線粒體質(zhì)粒 +qa2+ pALS1 轉(zhuǎn)化粗糙脈孢菌 pALS2（高頻轉(zhuǎn)化小質(zhì)粒） ii. 類質(zhì)粒（ plasmidlike)，如由柄孢殼 (Fedospora auseniw)的類質(zhì)粒 (2539bp)所構(gòu)建的克隆載體可達(dá) 10009000/μg的轉(zhuǎn)化率，可重新分離，無重組發(fā)生，其復(fù)制起點(diǎn)序列與酵母和海拉細(xì)胞線粒體質(zhì)粒復(fù)制子序列相同。 iii. 染色體復(fù)制子 ⅰ )構(gòu)巢曲霉（ )復(fù)制子 pILJ16()+AMA1() ARp1() 轉(zhuǎn)化頻率 20,000/106原生質(zhì)體 250ngDNA，可在黑曲霉()和米曲霉 ()以相同轉(zhuǎn)化頻率轉(zhuǎn)化。 1030 copies/單倍體基因組 ⅱ )玉米黑粉菌 (Ustilago maydis)復(fù)制子 9 104 /ng DNA， 25 copies/cell 2）整合型載體 由 構(gòu)成，轉(zhuǎn)化頻率 110/μg DNA 3）標(biāo)記基因 amds— 乙酰胺酶， dir— 線粒體 ATP合成酶， qa2分解奎尼酸脫氫酶， acuD— 異檸檬酸裂解酶， Hgyr— 潮霉素抗性。
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