【正文】 返回 四 、 M13載體 系列的優(yōu)點 在這類載體的基因組中有一條飾變的 β半乳糖苷酶基因片段 （ HindⅡ 片段 ） ， 其中插入了一段具有密集的多克隆位點的序列； M13載體系列是應(yīng)用基因工程技術(shù)成對地構(gòu)建的 ， 可有效地克隆雙鏈 DNA分子中的每一條鏈 。 ? 具有多克隆位點 (MCS)， 方便克隆 。 ? 許多 M13載體的多克隆位點與質(zhì)粒載體 pUC序列的多克隆位點是相同的 ， 在克隆位點選擇上更為方便 。 返回 可以 定向地克隆 DNA片段 ? 克隆在 M13 RF DNA分子上的雙鏈 DNA片段 ， 到了子代噬菌體便成了單鏈的形式 。 所以如果要同時分離ＤＮＡ分子中的雙鏈 ， 則需要兩種獨立的克隆 。 根據(jù)M13的生物學(xué)特性知道 ， M13子代噬菌體中總是只含有 （ ＋ ） 鏈 ， 所以 M13載體克隆的外源 DNA片段在子代噬菌體中究竟是含有 DNA分子中的哪條鏈 ， 則完全取決于外源ＤＮＡ克隆時的取向 。 這樣一來 ， 為分別分離外源ＤＮＡ分子的兩條鏈帶來一定的麻煩 ， 解決這一問題的一個行之有效的方法就是 定向克隆技術(shù) 。 M13mp18 MCS M13mp19 MCS EcoRI BamHI HindIII PstI BglI BglI PstI HindIII BamHI EcoRI B P P B B P B P P B BamHI amp。 PstI ? 噬菌體展示技術(shù)是將各種多肽或蛋白質(zhì)以融合蛋白 的形式表達并展示在噬菌體表面 ，同時將其遺傳密碼包含于噬菌體內(nèi)部 ， 這使得蛋白質(zhì)的功能與其基因密碼有機的連結(jié)在一起 。 五、噬菌體展示技術(shù) 非展示系統(tǒng) 展示系統(tǒng) （一）噬菌體展示技術(shù)的原理 ? M1 fd顆粒的一端表面存在 3～ 5拷貝的基因 Ⅲ 編碼的蛋白質(zhì) Lead M13基因 III 隨機多肽區(qū) Lead Hv Link Lv E PIII 融合蛋白 PIII 基因型 表達型 Solid phase selection with immunotubes B B B B B B v coated with steptavidin and biotinylated antigen B biotin antigen Solution phase selection with biotinylated antigen Bind to Streptavidin coated microtitre wells Wash to remove unbound phage particles. Elute bound phage Amplify eluted phage Repeat selection Analyze a) ELISA b) Specificity c) Sequencing d) Affinity e) Activity 感染 和擴增 二、 噬菌體抗體庫展示技術(shù) back 第五節(jié) 噬菌粒載體（ phagemid） 一 、 概念 ? 由 質(zhì)粒載體 和 單鏈噬菌體 載體結(jié)合而成的新型的載體系列 。 ? 具有質(zhì)粒的 復(fù)制起點 、 選擇性標記 、 多克隆位點 等 ，方便 DNA的操作 ， 可在細胞內(nèi)穩(wěn)定存在； ? 具有 單鏈噬菌體的復(fù)制起點 ， 在 輔助噬菌體 幫助下 ，可進行噬菌體的繁殖 ， 產(chǎn)生單鏈的子代噬菌體 。 ? 噬菌粒的特點 ? 比 M13小，約為 3000bp，易于體外操作，可以克隆 10kb外源 ? 兩種復(fù)制方式 ? 可以得到直接用于測序的單鏈結(jié)構(gòu)，免去了從質(zhì)粒載體到噬菌體的這一煩瑣的亞克隆步驟。 二、噬菌粒載體 pUC118和 pUC119 在 pUC18 和 19的 NdeⅠ 位點上插入來源于 M13的 IG 區(qū) ， 長度476bp ， 含有M13的復(fù)制起點 質(zhì)粒特點： ① 含有質(zhì)粒的復(fù)制起點 ， 形成大量的雙鏈DNA分子 ② 多克隆位點 ③ 藍白篩選 ④ 多拷貝 ， 每個宿主可達 500拷貝 ? 在 pUC118和 pUC119這兩個載體中 ， 多克隆位點區(qū)的核苷酸序列取向是彼此相反的 ， 于是它們當中的一個可轉(zhuǎn)錄克隆基因的正鏈 DNA，另一個則可轉(zhuǎn)錄出負鏈 DNA； ? 噬菌體的特點： ① 帶有一個 M13噬菌體的復(fù)制起點 ， 在有 輔助噬菌體 感染的寄主細胞中 ， 可以合成出單DNA拷貝 ， 并包裝成噬菌體顆分泌到培養(yǎng)基 三、輔助噬菌體 ? M13KO7 輔助噬菌體 （ 一 ） 結(jié)構(gòu) ? M13 的衍生株 ， 大小為 ? 來自 p15A 質(zhì)粒的復(fù)制起點 ， 因此可以象質(zhì)粒一樣復(fù)制 ， 且可以與帶 ColE1 的質(zhì)粒共存于同一個宿主菌中 。 ? 來自轉(zhuǎn)座子 Tn903 的卡那霉素抗性基因 （ kanr） ? 基因 Ⅱ 帶有一個 G 至 T 的突變 （ 第 6125 核苷酸 ） ，40 位 氨 基 酸 由 甲 硫 氨 酸 變 為 異 亮 氨 酸 。 ? 當 M13K07感染帶有噬菌粒的大腸桿菌后 ， 如（ pUC118） ， 進入宿主細胞內(nèi)的單鏈DNA， 在宿主胞內(nèi)酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈形式 ，后者可在質(zhì)粒 p15A的復(fù)制起點控制下進行復(fù)制 。 ? 細胞內(nèi) M13K07雙鏈 DNA的積累并不需要病毒基因產(chǎn)物 ， 細胞內(nèi)的噬菌粒幾乎沒有機會干擾所進入的 M13K07病毒基因組的早期復(fù)制 。 （二）作用 ? M13K07基因組雙鏈 DNA可表達產(chǎn)生子代單鏈 DNA所必需的所有蛋白 。 但 M13K07中突變的 基因 Ⅱ 產(chǎn)物與自身攜帶的噬菌體復(fù)制起點的作用尚不如克隆于噬菌粒 pUCll8和pUCll9中的病毒復(fù)制起點的作用有效 ， 這就使噬菌粒正鏈 DNA能夠優(yōu)先合成 ， 以確保在細胞所產(chǎn)生的病毒顆粒中來自噬菌粒的單鏈 DNA能夠占據(jù)優(yōu)勢 。 三 、 pBluescript噬菌粒載體 （ 一 ） 基本結(jié)構(gòu) 在多克隆位點的兩側(cè) ， 有一對 T3和 T7噬菌體的啟動子 ， 可以定向指導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)錄活動； 同時具有一個單鏈噬菌體 M13或 f1的復(fù)制起點和一個來自 ColE1質(zhì)粒的復(fù)制起點 ， 在不同的情況下 ， 可以采取不同的復(fù)制形式 ， 分別合成單鏈或雙鏈的 DNA； 編碼有一個氨芐青霉素抗性基因 ， 供作轉(zhuǎn)化子記號； 含有 lacZ基因 ， 可用 XgalIPTG組織顯色反應(yīng)法篩選噬菌粒載體 。 T7 T3 用于體外轉(zhuǎn)錄 總結(jié) 質(zhì)粒 λ噬菌體 柯斯質(zhì)粒 單鏈噬菌體 克隆 DNA大片段 177。 * + + 構(gòu)建基因組文庫 + + 構(gòu)建 DNA文庫 + 常規(guī)的亞克隆化 + 構(gòu)建新型的 DNA結(jié)構(gòu) + 序列分析 + + 單鏈探針 +** + 外源基因在大腸桿菌中的表達 + 四種常用載體的比較 * 外源 DNA如超過 10kb，則重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率和 DNA得率都非常低 ** 已有個別材料可用于此目的