【正文】 肝內酶活力。 注意滴定終點的控制，保證實驗的準確度 。 【 思考題 】 為什么說脂肪酸 β氧化實驗的關鍵是制備新鮮的肝糜 ? 什么叫酮體 ?為什么正常代謝時產生的酮體量很少 ? 實驗十 瓊脂糖膠電泳法分離乳酸脫氫同工酶 【 實驗目的 】 學習和掌握瓊脂糖凝膠電泳法分離乳酸脫氫酶同工酶的原理和方法。 【 實驗原理 】 能催化同一反應而蛋白質結構不同的酶，稱為同工酶。同工酶的蛋白結構既有差別，它們的理化性質也就有所差異，因此可用電泳或其他方法將它們分離開來。 本實驗是用瓊脂糖凝膠電泳法分離人血清乳酸脫 氫酶 5個同工酶（ LDH LDH2 、 LDH LDH4 和LDH5 ）。 【 實驗試劑與器材 】 巴比妥 — HCl緩沖液（ ， ） Na2溶液 %瓊脂糖凝膠 %~%瓊脂糖染色膠 顯色液 2%醋酸緩沖液 電泳用緩沖液（ ， ） 人血清 水平臺，水平儀 1烘箱 1電泳槽 1電泳儀 1微量注射器 【 實驗步驟 】 瓊脂糖凝膠板的制備和電泳 將 %瓊脂糖凝膠水浴加熱溶化，取 2ml溶化的凝膠液平澆于一潔凈的載玻片上。凝膠凝固后，于此凝膠板一端 1/3處，用小刀開一狹長小槽，用濾紙片仔細吸去小槽內液體。 用微量注射器向小槽內加入新鮮血清 10~15μl，將 凝膠板放在電泳槽內，兩端各以浸有電泳用緩沖液的紗布作鹽橋，點樣端靠近陰極。電泳 40~60min，電壓約100伏。 顯色 約于電泳終止前 10min，將 %~%瓊脂糖染色膠在水浴中溶化。取此溶化的凝膠 ，立即澆在電泳完畢的凝膠板上， 37℃ 避光保溫 1h，即顯示出五條深淺不等的藍紫色區(qū)帶。最靠近陽極端區(qū)帶是 LDH1，依次為 LDH2 、 LDH3和 LDH4， LDH5則移向陰極端。 固定與干燥 將顯色后的凝膠板浸于 2%醋酸溶液中， 2h后取出， 用一干凈濾紙覆蓋凝膠板上， 50℃ 烘 ~2h，烘干后，取去濾紙，背景即透明。 如需定量，可用光密度計測定各區(qū)帶。 實驗十一 酪蛋白的制備 【 實驗目的 】 學習從牛奶中制備酪蛋白的原理和方法。 掌握等電點沉淀法提取蛋白質的方法。 【 實驗原理 】 牛乳中的主要的蛋白質是酪蛋白 ， 含量約為35g/L。 酪蛋白是一些含磷蛋白質的混合物 ， 等電點為。 利用等電點時溶解度最低的原理 ， 將牛乳的 pH調至 ， 酪蛋白就沉淀出來 。 用乙醇洗滌沉淀物 ，除去脂類雜質后便可得到純酪蛋白 。 【 實驗試劑與器材 】 新鮮牛奶 95%乙醇 無水乙醚 —— 醋酸鈉緩沖液 乙醇 —— 乙醚混合液：乙醇 ∶ 乙醚 =1 ∶ 1（ V/V） 離心機 抽濾裝置 精密 pH試紙或酸度計 電爐 溫度計 【 實驗步驟 】 （一）酪蛋白的粗提 100mL牛奶加熱至 40℃ 。在攪拌下慢慢加入預熱至 40℃ 、 100mL，用精密 pH試紙或酸度 計調 pH至 。 將上述懸浮液冷卻至室溫。離心 15分鐘（ 3000 r /min）。棄去清液，得酪蛋白粗制品。 （二）酪蛋白的純化 3次，離心 10分鐘（ 3 000r/min），棄去上清液。 30mL乙醇，攪拌片刻，將全部懸濁液轉 移至布氏漏斗中抽濾。用乙醇 — 乙醚混合液洗沉淀 2次。最后用乙醚洗沉淀 2次，抽干。 ，風干；得酪蛋白純品。 （三）準確稱重，計算含量和得率。 含量：酪蛋白 g/100 mL牛乳 式中理論含量為 。 【 思考題 】 ？ 。 100%?測得含量得率:理論含量實驗十二 肝臟谷丙轉氨酶活力測定 【 實驗目的 】 掌握谷丙轉氨酶的測定方法。 【 實驗原理 】 谷丙轉氨酶作用于丙氨酸及 α酮戊二酸，生成谷氨酸與丙酮酸。丙酮酸與 ，生成二硝基苯腙，此物在堿性溶液呈紅棕色，與經同樣處理的標準丙酮酸比色，求得丙酮酸的生成量以表示酶的活性。 丙酮酸二硝基苯腙紅棕色2 , 4 二硝基苯肼C O O HCH2CH2C OC O O HC O O HCH2CH2C H N H2C O O HCH3C H N H2C O O HG P TCH3C OC O O HCH3C N NHNO2NO2H2OOHH2N HNNO2NO2C O O H【 實驗試劑與器材 】 標準丙酮酸 （現配） 谷丙轉氨酶底物 4℃ ， 1周 PB % 2,4二硝基苯肼溶液 NaOH 新鮮肝臟（購買或取活的小白鼠肝臟） 剪刀 或 組織搗碎機 37℃ 水浴 分光光度計（ 520nm） 比色皿 1計算紙（ 9 cm 9 cm） 【 實驗步驟 】 處理： 20g 肝先用生理鹽水洗凈，濾紙吸干水，再用預冷的 PB搗碎，并定容至 200ml，供全班用。 2. 谷丙轉氨酶活力的測定 1）取 4支試管，標注名稱，按照下表操作 2）計算酶活力 本法規(guī)定：酶在 37℃ 與底物作用 30分鐘，產生 丙酮酸為一個谷丙轉氨酶活性單位。 1）每 ml肝勻漿谷丙轉氨酶活力單位（ U/ml） 試管 試劑 ( m l ) 測定管 （ A ） 標準管 （ S ） 對照管 （ B ） 空白管 谷丙轉氨酶底物 —— —— 37 ℃ 水浴 5 分鐘 肝勻漿 （標準丙酮酸） （ H2O ） 混勻后 37 ℃ 水浴 準確 保溫 30 分鐘 二硝基苯肼 谷丙轉氨酶底物 —— —— 混勻后 37 ℃水浴 準確保溫 20 分鐘 N a O H 各加 5m l ，混勻，靜置 10 m i n ，讀 A 52 0nm A 52 0nm 2）每 g 肝臟谷丙轉氨酶活力單位（ U/g） D’ = D 200 / 20 說明： A：樣品 A 520nm B：對照 A 520nm S：標準 A 520nm 500：標準丙酮酸濃度 ：谷丙轉氨酶換算單位系數 200： 200ml肝勻漿 20： 20g肝 ? ? ? ?S2 0 0BA5 0 0BAD ???????【 附注 】 2,4二硝基苯肼與丙酮酸的顏色反并不是特異性意 的， α酮戌二酸也能與 2,4二硝基苯肼作用而顯 色。 2,4二硝基苯肼身也有類似的顏色，因此空白管顏 色較深。