【正文】 線上查找蛋白質(zhì)濃度。以A595為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)年濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 待測蛋白：人血清，用前用 %NaCl稀釋 200倍。 【 實(shí)驗(yàn)試劑與器材 】 標(biāo)準(zhǔn)蛋白液（ ） %NaCl 稀釋到 2022ml。測定范圍為 10100μg蛋白質(zhì)，微量測定時(shí)達(dá)到 110μg蛋白質(zhì)。染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后有紅色 棕黑色和藍(lán)色形式，最大光吸收由 465nm變成 595nm，測定 595 nm吸光的增加量，可以測定與其結(jié)合的蛋白質(zhì)的量。 【 實(shí)驗(yàn)原理 】 考馬斯亮藍(lán)測定蛋白質(zhì)含量是利用蛋白質(zhì) 染料結(jié)合法的原理，定量測定微量蛋白質(zhì)濃度快速、靈敏的方法。 (5)根據(jù)目的、要求，選擇合適溶劑系統(tǒng)。 (3)展層結(jié)束后，切 勿忘記 用鉛筆描出溶劑前沿。 【 注意事項(xiàng) 】 (1)在整個(gè)操作過程中，手只能接觸濾紙 邊緣 ，否則手指上的氨基酸會造成濾紙上眾多斑點(diǎn)。用鉛筆描出斑點(diǎn)輪廓 (見圖 2)。 當(dāng)溶劑前沿到達(dá)離上端 2 cm處，取出濾紙，用鉛筆描出溶劑前沿，晾干。 3．層析 將點(diǎn)好樣的濾紙縱向卷起來，點(diǎn)樣面向里，點(diǎn)樣點(diǎn) 位于一端，用針線縫成筒狀，不要使濾紙兩邊接觸 (見圖1)。 2．點(diǎn)樣 在每個(gè)圈下用鉛筆記上每種氨基酸的代號（混合樣可寫 M），然后用毛細(xì)管吸取樣品，輕輕地點(diǎn)到相應(yīng)的氨基酸圈內(nèi)，待晾干或用冷風(fēng)吹干后再點(diǎn) 1次。 1 722型（或 7220型）分光光度計(jì)。 微量注射器 10μl （ 1）或毛細(xì)管。 剪刀。 濾紙。 【 實(shí)驗(yàn)試劑與器材 】 溶劑系統(tǒng) （ 1）堿相溶劑： 正丁醇 :12%氨水 :95%乙醇＝ 13:3:3（體積比） （ 2）酸相溶劑： 正丁醇 :80%甲酸 :水＝ 15:3:2（體積比） 顯色貯備液： %水合茚三酮丙酮溶液 V（ %硫酸銅） :V（ 75%乙醇） =2:38溶液。 Rf值的定義為： Rf =(原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離 )/（原點(diǎn)到溶劑前沿的距離） 用紙層析鑒定樣品時(shí)，一般都與標(biāo)準(zhǔn)品相比較。極性小的物質(zhì)在有機(jī)相中分配較多，隨有機(jī)相移動(dòng)較快；而極性大的物質(zhì)在水相中分配較多，移動(dòng)相對較慢，從而將極性不同的物質(zhì)分開。由于濾紙纖維素上的羥基和水分子有較大的親和力，而與有機(jī)溶劑的親和力相對較弱，因此我們認(rèn)為水相為固定相，有機(jī)溶劑相為移動(dòng)相。此法廣泛地應(yīng)用于科研和生產(chǎn)分析工作中。紙上層析法是分離、鑒定和定量測定氨基酸、糖類、抗生素等有機(jī)物質(zhì)的一項(xiàng)重要而簡便的分析方法。 。 目 錄 ? 實(shí)驗(yàn)一 氨基酸的分離鑒定 —— 紙層析法 (操作性 ) 4學(xué)時(shí) ? 實(shí)驗(yàn)二 考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法測定蛋白質(zhì)濃度 (操作性 ) 3學(xué)時(shí) ? 實(shí)驗(yàn)三 血清蛋白的醋酸纖維薄膜電泳 (驗(yàn)證性 ) 5學(xué)時(shí) ? 實(shí)驗(yàn)四 動(dòng)物肝肝臟 DNA的分離與鑒定 (操作性 ) 3學(xué)時(shí) ? 實(shí)驗(yàn)五 血液中葡萄糖的測定 (操作性 ) 3學(xué)時(shí) ? 實(shí)驗(yàn)六 血清中總膽固醇的測定 (操作性 ) 4學(xué)時(shí) ? 實(shí)驗(yàn)七 唾液淀粉酶活性的觀察 (綜合性 ) 4學(xué)時(shí) ? 實(shí)驗(yàn)八 維生素 C的定量測定 (操作性 ) 4學(xué)時(shí) ? 實(shí)驗(yàn)九 脂肪酸的 β氧化 (操作性 ) 4學(xué)時(shí) ? 實(shí)驗(yàn)十 瓊脂糖膠電泳法分離乳酸脫氫同工酶 (操作性 ) 4學(xué)時(shí) ? 實(shí)驗(yàn)十一 酪蛋白的制備 (操作性 ) 4學(xué)時(shí) ? 實(shí)驗(yàn)十二 肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力測定 (綜合性 ) 3學(xué)時(shí) 實(shí)驗(yàn)一 氨基酸的分離鑒定 —— 紙層析法 【 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?】 ?！?生物化學(xué)實(shí)驗(yàn) 》 課程簡介 生物化學(xué)課程是一門與生物技術(shù)相關(guān)的專業(yè)基礎(chǔ)必修課，本實(shí)驗(yàn)課程是附屬于該課程的一個(gè)教學(xué)環(huán)節(jié)，開設(shè)操作性、驗(yàn)證性、綜合性等實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要進(jìn)行生物分子（蛋白質(zhì)、核酸、糖、維生素）的定性、定量測定和分離提取制備，學(xué)習(xí)酶活性和維生素的測定方法等實(shí)驗(yàn)，涉及了生物化學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)及典型儀器設(shè)備。通過實(shí)驗(yàn)有助于學(xué)生加深對生物化學(xué)的基本知識和基本理論的理解，掌握生物化學(xué)的主要方法與技術(shù)，包括經(jīng)典的、常規(guī)的、以及現(xiàn)代的方法與技術(shù)。 。 【 實(shí)驗(yàn)原理 】 紙上層析法是分配層析法中的一種，常以濾紙為惰性支持物。所用設(shè)備簡單、操作方便，使用樣品少，分離效果好，為近 代生物化學(xué)分析中重要技術(shù)之一。 紙上層析的原理：常以水和有機(jī)溶劑作為展層劑；水和有機(jī)溶劑互溶后形成兩個(gè)相：一個(gè)是飽和了有機(jī)溶劑后的水相，一個(gè)是飽和了水后的有機(jī)溶劑相。由于物質(zhì)的極性大小不同，在兩相中分配比例有所差異。一般來說，在相同的條件下，每種物質(zhì)都有其固定的 Rf 值。若沒有標(biāo)準(zhǔn)品，可選擇文獻(xiàn)記載的該物質(zhì)層析條件，根據(jù)文獻(xiàn) Rf值進(jìn)行鑒定 。 混合氨基酸溶液 6mg/ml。 燒杯 10ml（ 1）。 層析缸（ 2）。 電吹風(fēng)（ 1）。 【 實(shí)驗(yàn)步驟 】 1．紙的處理 取 18 cm長、 18 cm寬的濾紙一張，離底邊 2 cm處用鉛筆輕輕劃一條與底邊平行的線，并等距離的在線上定點(diǎn)樣點(diǎn) (原點(diǎn) )劃圈，使圈的直徑小于 cm。每個(gè)樣品共點(diǎn) 2次。 將培養(yǎng)皿中放入 2／ 3量的展層劑，放入層析缸中，然后將濾紙直立于層析缸的培養(yǎng)皿中，樣品端向下垂直放置，切勿使展層劑浸到樣品點(diǎn)，開始層析。 圖 1 濾紙的縫合 4．顯色 用噴霧器向?yàn)V紙上均勻噴灑 %茚三酮，晾干后，將濾紙放入烘箱中 (80100℃ )，烘烤 5分鐘后，濾紙上即顯出紫紅色的氨基酸斑點(diǎn)。 圖 1．原點(diǎn)； 2．層析點(diǎn)； 3．溶劑前沿 5 ．計(jì)算 用尺量出原點(diǎn)到斑點(diǎn)中心距離以及原點(diǎn)到溶劑前沿距離，計(jì)算各標(biāo)準(zhǔn)氨基酸和混合氨基酸的 Rf值。 (2)在 點(diǎn)樣時(shí)，不要將毛細(xì)管插錯(cuò)了試劑瓶 。 (4) 點(diǎn)樣斑點(diǎn)不能太大（其直徑應(yīng)小于 ），防止氨基酸斑點(diǎn)重復(fù)；吹風(fēng)溫度不宜過高，否則斑點(diǎn)變黃。 實(shí)驗(yàn)二 考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法測定蛋白質(zhì)濃度 【 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?】 學(xué)習(xí)考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度的原理和方法。 考馬斯亮藍(lán) G250存在著兩種不同樣色形式，紅色 棕黑色和藍(lán)色。 蛋白質(zhì)與染料結(jié)合速度很快， 2min就可以反應(yīng)完全，并可以穩(wěn)定 1h，蛋白質(zhì) 染料復(fù)合物有很大的消光系數(shù)，使得測定蛋白質(zhì)濃度是靈敏度很高。此反應(yīng)反復(fù)性好精度高，線性關(guān)系好。 %NaCl 考馬斯亮藍(lán)試劑： 100mg考馬斯亮藍(lán) G250溶于 50ml 5%乙醇中，加 100ml85%磷酸，蒸餾水稀釋 1000ml，濾紙過濾。 漩渦混合器 移液管 （ 2）， （ 2）， 5ml（ 1） 分光光度計(jì) 試管 15cm ( 8) 量筒 100ml( 1) 電子分析天平 1試管架 ( 1) 【 實(shí)驗(yàn)步驟 】 一、標(biāo)準(zhǔn)曲線線的繪制 取 7支干凈試管，按下表進(jìn)行編號并加入試劑。 試管號 試劑 1 2 3 4 5 6 1mg/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白液 /ml NaCl/ml 1 考馬斯亮藍(lán)染液 /ml 搖勻， 1小時(shí)內(nèi)以 1號管為空白對照，在 595nm處比色 A595nm 二、未知樣液的測定 另取一干凈試管，加入樣品 ，混勻，室溫靜置 3min，于波