【正文】 合碳源時在60h活性最大，為25365U/mL。因此，混合碳源的利用，不僅可以增加植酸酶的表達量，而且還縮短了誘導時間，因為甲醇是醇氧化酶（AOX1）基因啟動子的誘導劑，山梨醇可以加速這種誘導過程。有助于減少誘導時間，醇氧化酶（AOX1）基因啟動子調控植酸酶的表達，因此植酸酶的表達量也增加。 基因工程菌發(fā)酵罐培養(yǎng)條件研究為了使測試結果在工業(yè)生產中盡快被使用，盡可能早日實現(xiàn)其經濟和社會效益，該項目已完成一些前期工作，對2L發(fā)酵罐發(fā)酵生產過程中的的一部分工藝進行了研究和優(yōu)化。 生長階段pH研究發(fā)酵罐培養(yǎng)基pH值對畢赤酵母的細胞的生長和產酶的影響，, ，培養(yǎng)兩小時后，每4h測定細胞濃度，用山梨醇 甲醇混合碳源誘導60h后對活性測定。pH值對細胞生長階段的影響如圖211所示。圖211 生長階段pH對菌體濃度的影響 The effect of pH on yeast concentration at growth phase從圖211可以看出，在發(fā)酵罐的菌體生長階段， ，菌體濃度最高，，細胞濃度最小，所以我們可以看到，過低的pH值是不利于細菌的生長。如圖212所示的結果生長階段pH值對產酶的影響。圖212 生長階段pH對產酶的影響 The effect of pH on the production of phytase at growth phase圖212可以看到植酸酶活性隨pH值的增加呈上升的趨勢。綜合圖211和212的結果表明，搖瓶發(fā)酵階段階段的工程菌的最適生長pH值和最佳表達pH值不相同。成長階段是獲得活力細菌，生物量積累為主要目，誘導期再調整pH值，以得到最大活性。因此。 誘導階段pH研究的畢赤酵母發(fā)酵罐培養(yǎng)基pH值對細胞的生長和產酶的影響，,，培養(yǎng)2h，每過4小時測定細胞濃度，山梨糖醇 甲醇混合碳源誘導60h后，測定的活性測定。pH值對細胞的生長和產酶的誘導階段的影響，結果如圖212所示。圖212 誘導階段pH對菌體濃度和產酶的影響 The effect of pH on yeast concentration and the production of phytase at inducing phase圖212顯示，植酸酶酶活性隨pH值的增加而增加，活性達到最大是在pH ，植酸酶酶活性降低。因此。綜合工程菌搖瓶培養(yǎng)階段的最適pH發(fā)酵階段的最適pH值，發(fā)現(xiàn)無論是搖瓶或發(fā)酵，最適生長pH值與最佳產酶pH值不相同，搖瓶和發(fā)酵罐之間也有差異。發(fā)酵罐發(fā)酵條件控制優(yōu)于搖瓶。 誘導時間發(fā)酵階段的誘導時間，從加入碳源誘導每6h植酸酶活性測定，結果如圖213所示圖213 誘導時間對產酶的影響 The effect of induction time on the production of phytase圖213顯示了前54小時，迅速合成大量的植酸酶，酶活性增加，54 h酶的活性不再上升。因此選擇發(fā)酵階段歸納為54 h。因此，誘導時間使用混合碳源縮短了12小時發(fā)酵周期，繼續(xù)縮短了6小時。 本章小結此次實驗通過搖瓶發(fā)酵時對畢赤酵母工程菌酶活性和菌體濃度的研究發(fā)現(xiàn)，畢赤酵母菌種最佳種齡為22h、最佳菌種接種量5%、，誘導所需時間為72h以及采用混合碳源山梨醇甲醇對誘導要優(yōu)于甲醇單一碳源，25%山梨醇和甲醇的最佳比例（V/V）為1∶6。最終酶活達到25365U/mL發(fā)酵液。通過對畢赤酵母發(fā)酵罐發(fā)酵生產植酸酶的培養(yǎng)階段，以及生長階段最適pH值，誘導階段的最適pH值以及最佳的誘導時間進行了研究，最終確定了發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)畢赤酵母產植酸酶的最佳發(fā)酵條件。，搖瓶培養(yǎng)畢赤酵母條件與這些不同。試驗確定發(fā)酵罐發(fā)酵畢赤酵母產植酸酶培養(yǎng)階段的最適的誘導時間是54h。發(fā)酵完畢后最終的植酸酶酶活性達到了31985U/mL發(fā)酵液。結 論本論文初步介紹了植酸酶的基本知識，包括植酸酶分類、植酸酶來源、植酸酶應用等基本概況，并從兩部分實驗研究畢赤酵母工程菌發(fā)酵產植酸酶的搖瓶培養(yǎng)實驗和發(fā)酵罐培養(yǎng)實驗，兩個部分討論了若干影響因素對畢赤酵母植酸酶表達的影響因素，并將發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。發(fā)酵產植酸酶過程中的影響因素研究及其發(fā)酵條件的優(yōu)化通過對畢赤酵母工程菌發(fā)酵產植酸酶的搖瓶培養(yǎng)實驗和發(fā)酵罐培養(yǎng)實驗過程影響因素的研究，將發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，使發(fā)酵產的植酸酶的酶活性得到了很大的提升。對畢赤酵母進行誘導產酶，使用山梨醇甲醇混合碳源，發(fā)現(xiàn)使用山梨醇甲醇混合碳源酶活性高于甲醇作為唯一碳源，最終酶活達31985U/mL發(fā)酵液。參考文獻1 [D] .四川農業(yè)大學碩士學位論文，2005,6月2 李曉龍, 楊合同, 吳遠征, 等. 植酸酶的多樣性及其分類[J] . 農產食品科技, 2010,5月3 杜麗敏, 段相林. 植酸酶的來源與應用[J]. 安徽農業(yè)科技, 2007, 8月4 施安輝, 王光玉. 目前國內外植酸酶研究進展[ J] . 中國釀造, 2005( 5) : 5~ 10.5 李秀娟, 尹玲, 李秀珍, 黃賢剛. 植酸酶畢赤酵母基因工程菌發(fā)酵條件的優(yōu)化[J] . 2010, 5月6 汪世華, 呂茂洲, 孫長春, 等. 植酸酶的現(xiàn)狀及其研究進展. 2005, 9月7 楊燕凌, 沙莉, 方金銅. 微生物植酸酶的研究與應用. 武夷科學, 2007, 23: 1911958 郭會燦, 杜娜. 植酸酶在工業(yè)中的應用. 河北工業(yè), 2008, 31(11): 10119 葉冰, 王運吉, 張苓花. 植酸酶畢赤酵母基因工程菌高密度發(fā)酵. 大連輕工業(yè)學報, 2002, 21(3): 19319610 周德慶. 微生物學教程. 第2版. 北京：高等教育出版社, 2006: 15916011 M. HASSLACHER, M. Schall, M. HAYN, et al. Highlevel Intracellular Expression of Hydroxyl nitrile Lyase from the Tropical Rubber Tree Hevea Brasiliensis in Microbial Hosts. Protein Expres Purif, 1997, 11(1): 617112 A. S. XIONG, Q. H. YAO, R. H. PENG, et al. Highlevel Expression of a Synthetic Gene Encoding Peniophora Lycii Phytase in Methylotrophic Yeast Pichia Microbiol Biotechnol, 2006, 72(5): 1039104713 K. SANO, H. FUKUHARA, Y. NAKAMURA. Phytase of the Yast Arxula Adeninivorans. Biotec hnol. Lett, 1999, 21: 333814 T. R. SHIEH, J. H. WARE. Survey of Microorganisms for the Production of Extracellular Phytase. Appl. Microbiol, 1968, 169(9): 1348135115 C. LAMBRECHTS, H. BOZE, G. MOULIN, et al. Utilization of Phytase by Some Yeast. Biotechnol. Lett, 1992, 14(1): 636616 A. VOHRA, T. SATYANARAYANA. Statistial Optimization of the Medium Components by Response Surface Methodology to Enhance Phytase Production by Pichia Biochem, 2002, 37: 9991004