蔗糖酶理論講授ppt課件-資料下載頁
2025-05-26 00:13本頁面
【正文】 (1) 非竟爭性抑制 28 蔗糖酶米氏常數(shù)的測定（本實驗） 1）將離子交換柱層析得的 E3稀釋 ( HAC緩沖液 )至 30U/mL，共 16ml。 2）取試管 8支，按 0— 7編號， 0為對照管。 3）按 P146頁表將蔗糖液、醋酸緩沖液分別加入試管中，于 35℃ 水浴中保溫（使溫度平衡，以下同） 10min。 4）取 16ml酶液，放入同一水浴中保溫約 10min。 5）于各管中依次按同樣時間間隔加入已保溫過的酶液 2ml，記時，立即搖勻。在 35℃ 水浴中準確反應(yīng) 3min。 6）按同樣次序和時間間隔，加入 1mol/L NaOH，搖勻，終止反應(yīng)。 7）吸取反應(yīng)混合物 ，加入盛有 3ml DNS試劑和 中，放入沸水中加熱 5min，冷卻后稀釋定容至 25ml，搖勻后，測定 A540值 29 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 Sodium Dodecyl Sulfate, Polyacrylamid Gel Electrophoresis, SDSPAGE 30 電泳： 是指帶電粒子在電場的作用下，發(fā)生定向 泳動的現(xiàn)象。 電泳技術(shù)： 指利用電泳現(xiàn)象對混合物進行分離分析的技術(shù)。 電泳？ 31 蛋白質(zhì)分子狀態(tài)在自然狀態(tài)下蛋白質(zhì)通過二硫鍵聚合形成高度折疊的生物大分子，在水溶液中，由于氨基酸殘基的解離作用使蛋白質(zhì)分子形成帶有一定凈電荷的分子 , 在電場下向自身電荷相反的方向移動。 32 ,用移液槍快速加入，距梳齒下緣約 1cm，之后加少許蒸餾水，靜置直到膠與水層間出現(xiàn)清晰界面。 ※ 加速劑 TEMED要在 注膠前加入 ，否則凝結(jié)無法注膠。 ※ 注膠過程最好一次性完成，避免產(chǎn)生氣泡。 ※ 水封的目的是為了使分離膠膠面平整，并排除氣泡。 ※ 凝膠聚合好的標志是膠與水層之間形成清晰的界面。 4. 倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干 ,按比例配好濃縮膠，連續(xù)平穩(wěn)加 入濃縮膠至短玻璃板上緣 ，迅速插入樣梳 ,靜置直到膠凝好。 ※ 樣梳需一次平穩(wěn)插入，梳口處不得有氣泡，梳底需水平。 實驗過程 33 5. 在上槽內(nèi)加入電極緩沖液，拔出樣梳。 ※ 要使鋸齒孔內(nèi)的氣泡全部排出，保證電流通暢。 。加樣前 ,樣品在沸水中加熱 3分鐘，去掉亞穩(wěn)態(tài)聚合。 ※ 進樣要緩慢，不要使樣品漂出泳道外面。 ※ 移液槍不可過低 ,以防刺破膠體 ,也不可過高 ,在樣下沉時會發(fā)生擴散。 ※ 為避免邊緣效應(yīng) ,最好選用中部的孔注樣。 實驗過程 34 7. 電泳槽中加入緩沖液，接通電源，進行電泳，開始電流恒定在10mA，當進入分離膠后改為 20mA， 溴酚藍距凝膠邊緣約 5mm時，停止電泳。 8. 凝膠板剝離與染色：電泳結(jié)束后，將上樣槽的電極緩沖液倒入指定容器，取下電泳膠玻璃板，用楔形工具小心將玻璃板撬開，將凝膠板和溴酚藍染料區(qū)帶中心做好標記。切除濃縮膠并沖洗后放入大培養(yǎng)皿內(nèi)，加入染色液，染色 1小時左右。 ※ 剝膠時要小心 ,保持膠完好無損 ,染色要充分。 9. 脫色：回收染色液，凝膠板先用水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰，確定目的蛋白條帶位置，估算分子量，比較不同純化過程對雜蛋白去除情況。 實驗過程
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