蔗糖酶理論講授ppt課件(已修改)
2025-06-07 00:13 本頁面
【正文】 1 三、實(shí)驗(yàn)步驟及原理 蔗糖酶的提取 蔗糖酶的純化 各純化級別蔗糖酶的活性測定 各純化級別蔗糖酶的蛋白質(zhì)含量測定 正交試驗(yàn)法測定不同條件對蔗糖酶活性的影響 蔗糖酶酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定分子量 2 蔗糖酶的提取 (細(xì)胞破壁 ) ? 自溶法破壁（本實(shí)驗(yàn)） 干酵母粉 溶于蒸餾水 乙酸鈉 乙酸乙酯 35℃ 恒溫 攪拌 40分鐘 35℃ 恒溫過夜 補(bǔ)加蒸餾水 攪拌均勻，成糊狀 離心 棄沉淀及脂層 E1 ? 記錄生產(chǎn)廠家和批號 ? 用硫酸紙封嚴(yán)（過夜） 3 E1 用稀 HAC 調(diào) pH至 乙醇分級 (32%乙醇飽和度 )Ι 離心， 取上清 乙醇分級 (%乙醇飽和度 ) Ⅱ 離心， 取沉淀 透析 磷酸緩沖液 5mmol/L 過夜 離心， 取上清 E2 E2 E3 DEAE52 離子交換層析 E3 E4 SephadexG100 凝膠層析 蔗糖酶的純化 4 1. 酶的蛋白屬性； 2. 調(diào)節(jié)酶溶解度的方法； 有機(jī)溶劑分級沉淀 3. 根據(jù)酶分子大小、形狀不同的分離方法； 透析、凝膠層析 4. 根據(jù)酶分子電荷性質(zhì)的分離方法； 離子交換層析 5. 根據(jù)酶分子專一性結(jié)合的方法 。 酶的純化方法 5 2. 調(diào)節(jié)酶溶解度的方法； 酶的純化方法 （ 1）改變離子強(qiáng)度； 鹽溶 / 鹽析 硫酸銨分級沉淀 （反抽提法） （ 2）改變 pH或溫度； （ 3）改變介電常數(shù)； 有機(jī)溶劑分級沉淀： 向水溶液中加入一定量親水性的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法。 ? 親水性有機(jī)溶劑加入溶液后 降低介質(zhì)的介電常數(shù) ， 使溶質(zhì)分子之間的靜電引力增加 ， 聚集形成沉淀 。 ? 親水性有機(jī)溶劑的水合作用降低了自由水的濃度 ， 壓縮了表面水化膜的厚度 ， 降低其親水性 ， 導(dǎo)致脫水凝集 。 6 有機(jī)溶劑分級沉淀操作條件的控制 ? 溶劑選擇 常用的溶劑是 乙醇、丙酮、甲醇 ，二甲基甲酰胺、二甲基亞砜也可做沉淀劑。沉淀用有機(jī)溶劑的選擇主要應(yīng)考慮沉淀作用強(qiáng)、對生物分子的變性作用小、毒性小以及揮發(fā)性適中。 ? 溫度 使用有機(jī)溶劑沉淀生物大分子時(shí)應(yīng)控制在低溫下進(jìn)行。 ? 樣品濃度的控制 一般認(rèn)為蛋白質(zhì)的初始濃度為 %2% 為好。 7 3. 根據(jù)酶分子大小、形狀不同的分離方法； 酶的純化方法 （ 1）離心分離； （ 2）透析、超濾； （ 3）凝膠層析 （ gel chromatography） ? 凝膠層析的定義： 凝膠是一種具有多孔、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的分子篩。利用這種凝膠分子篩對大小、形狀不同的分子進(jìn)行層析分離，稱凝膠層析 ? 凝膠層析 常見名稱： 凝膠過濾、分子篩層析、排阻層析、凝膠滲透層析 。 8 ? 凝膠層析的基本原理 ? 凝膠層析是利用凝膠把分子大小不同的物質(zhì)分離開的一種方法，其原理是
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