【正文】 鼠傷寒沙門(mén)菌ATCC l3311陽(yáng)性；宋內(nèi)志賀菌ATCC ll060陰性。[保存] 置4℃冰箱，2周內(nèi)用完。（Optochin sensitivity test)[用途] 測(cè)定細(xì)菌對(duì)化學(xué)藥品奧普托欣敏感性。 [配法] 奧普托欣（Optochin，乙基氫化羥基奎寧，ethylhydrocupreine hydrochloride)10mg溶于10m1蒸餾水中，取1m1，加入200片直徑6mm的滅菌紙片中，使其充分吸收，于37℃烘干備用。每片含Optochin 5μg或?qū)?mm的濾紙條浸于1﹕4 000的Optochin水溶液中，取出烘干備用。[用法]將被檢菌的肉湯培養(yǎng)物用無(wú)菌棉棒均勻涂布于血瓊脂平板上，取optochin紙片貼于平板上，35~37℃培養(yǎng)18~24h。抑菌圈在18mm以上為敏感，無(wú)抑菌圈或抑菌圈＜10mm為耐藥。 [質(zhì)量控制] 肺炎鏈球菌(ATCC l0015)陽(yáng)性?；撔枣溓蚓?ATCC l9615)陰性。 注：如果分離物生長(zhǎng)稀少，則很難正確判定結(jié)果。其判定敏感的最低標(biāo)準(zhǔn)為抑菌環(huán)直徑15~16mm或更大；若＜15mm，應(yīng)加做膽汁溶解試驗(yàn)來(lái)確定。 6. O/129試驗(yàn)紙片[用途] 用于弧菌屬的鑒定。 [配法] O/129 50mg溶于50ml無(wú)水乙醇中，取1ml加入100片直徑6mm的無(wú)菌濾紙片中，吸收后于37℃烘干備用。每片濾紙含O/129 10μg。 [用法]將待檢菌的肉湯涂布于堿性瓊脂平板，取O/129紙片貼于平板上，35℃培養(yǎng)18~24h。平板出現(xiàn)抑菌圈為陽(yáng)性，無(wú)抑菌圈為陰性。 [質(zhì)量控制] 創(chuàng)傷弧菌陽(yáng)性；親水氣單胞菌陰性。 [用途] 用于鑒定鏈球菌。 [配法] ，葡萄糖 2g/L。，加入葡萄糖溶解后，分裝試管，每管2~3m1， 121℃滅菌15min，備用。[用法] 將待檢菌接種培養(yǎng)基，置35℃培養(yǎng)18~24h。培養(yǎng)基有混濁物為陽(yáng)性。 [質(zhì)量控制] 糞腸球菌 ATCC 29212陽(yáng)性；化膿性鏈球菌 ATCC l0389陰性[保存] 4℃冰箱保存，2周內(nèi)用完。 [用途] 主要用于屬間的鑒別，生長(zhǎng)有：弗氏枸櫞酸桿菌、克雷伯菌腸桿菌菌群、銅綠假單胞菌；不生長(zhǎng)：沙門(mén)菌亞利桑那菌群、大腸埃希菌、糞產(chǎn)堿桿菌。 [配法] 蛋白胨10g,氯化鈉5g,磷酸二氫鉀 ,磷酸氫二鈉 ,蒸餾水lL。將上述成分加熱溶解在三角燒瓶中， 121℃滅菌15min，臨用時(shí)加入50g/L ，分裝于無(wú)菌試管中，一份不加氰化鉀作對(duì)照。[用法] 取純培養(yǎng)物接種兩管，1支氰化鉀實(shí)驗(yàn)管，1支對(duì)照管，置35℃培養(yǎng)24~72h。陽(yáng)性結(jié)果為實(shí)驗(yàn)管混濁，對(duì)照管混濁；陰性結(jié)果(敏感)為實(shí)驗(yàn)管清晰(不生長(zhǎng))，對(duì)照管混濁(生長(zhǎng))。 [質(zhì)量控制] 銅綠假單胞菌ATCC 27853生長(zhǎng)；福氏志賀菌不生長(zhǎng)。 [保存] 置冰箱內(nèi)，1周用完。注：⑴ 氰化鉀抑菌能力與接種菌量及培養(yǎng)基成分有很大關(guān)系，所以在試驗(yàn)時(shí)接種菌量不宜過(guò)多。 ⑵ 氰化鉀劇毒，使用時(shí)注意安全。氰化鉀培養(yǎng)基廢棄前(無(wú)論是否用過(guò))，應(yīng)作無(wú)害化處理：向每管加400 g/L 。 [用途] ⑴ 幫助腸桿菌屬與大腸埃希菌屬，葡萄球菌屬與微球菌屬的屬間鑒別；（2）幫助肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、臭鼻克雷伯菌、鼻硬結(jié)克雷伯菌間的菌種鑒別； （3）幫助蜂房哈夫尼亞菌與小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的菌種鑒定。 （4）用于VP試驗(yàn)。 [配法] 多價(jià)蛋白胨7g，葡萄糖5g，磷酸氫二鉀5g，蒸餾水1L。將上述成分混合溶解后，調(diào)pH至，分裝小試管， 121℃滅菌15min.置4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。[用法]取18~24h培養(yǎng)物小量接種，35℃孵育24~48h，有時(shí)可能延長(zhǎng)數(shù)天。有些細(xì)菌，特別是哈夫尼亞菌，在35℃孵育時(shí)VP試驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定，但在25~30℃下則呈陽(yáng)性。若懷疑為哈夫尼亞菌時(shí)，可重復(fù)VP試驗(yàn)并在25℃孵育。觀察方法：（1）奧梅拉(OMeara)法 試劑： 氫氧化鉀 40g、蒸餾水100m1。首先將氫氧化鉀溶解。然后加肌酐保存3~4周。觀察時(shí)按培養(yǎng)基試劑10﹕1比例滴加試劑，混合，置37℃4h或48℃2h，充分振搖，變紅色為陽(yáng)性。（2）貝立脫 (Barritt)法 試劑甲液： 60g/L甲萘酚乙醇溶液；乙液：400g/L氫氧化鉀溶液。觀察時(shí)按每2m1培養(yǎng)物加甲液lml，置35℃15~30min出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性，若無(wú)紅色，應(yīng)置35℃4h后再判定，本法較奧氏法敏感。 [質(zhì)量控制] 大腸埃希菌 ATCC 25922陰性；陰溝腸桿菌陽(yáng)性。[保存] 培養(yǎng)基置4℃冰箱，2周內(nèi)用完。試劑易失效，應(yīng)用前應(yīng)進(jìn)行質(zhì)量控制。注：⑴ 加入OMeara試劑后要充分混合，促使乙酰甲基甲醇氧化，使反應(yīng)易于進(jìn)行。 ⑵ 試劑必須用已知陽(yáng)性和陰性的標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行對(duì)照檢查。 ⑶ 試劑中加入400 g/L 氫氧化鉀是為了吸收二氧化碳。，且次序不能顛倒。 ⑷ 貝立脫方法是相當(dāng)敏感的，它可檢出以前認(rèn)為VP試驗(yàn)陰性的某些細(xì)菌。 ⑸ 許多實(shí)驗(yàn)室工作人員有一個(gè)錯(cuò)誤的印象，即VP試驗(yàn)陽(yáng)性菌MR試驗(yàn)自然是陰性，或反之亦然。實(shí)際上，腸桿菌科的大多數(shù)細(xì)菌產(chǎn)生相反的反應(yīng)（由于乙酰甲基甲醇形成堿性增加導(dǎo)致MR陰性和VP陽(yáng)性）。某些細(xì)菌如蜂房哈夫尼亞菌(哈夫尼腸桿菌37℃下孵育和奇異變形桿菌可產(chǎn)生MR和VP同時(shí)陽(yáng)性反應(yīng)，后者常延遲出現(xiàn)。⑹ α萘酚乙醇溶液易失效，試劑放室溫暗處可保存1月。氫氧化鉀溶液可長(zhǎng)期保存。國(guó)內(nèi)多采用貝立脫法。 [用途] 檢查細(xì)菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸的能力；用于鑒別某些細(xì)菌，如大腸埃希菌(陽(yáng)性)、產(chǎn)氣桿菌(陰性)、陰溝桿菌(陰性)，克雷伯菌屬一般為陰性，耶爾森茵屬陽(yáng)性，其它革蘭陰性非腸道桿菌陰性，單核李斯特菌陽(yáng)性。 [配法] ⑴ 葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基(見(jiàn)前)。 ⑵ 試劑：，95％乙醇300m1，蒸餾水200m1。 [質(zhì)量控制] 大腸埃希菌ATCC 25922陽(yáng)性；產(chǎn)氣腸桿菌陰性。注：⑴ 試劑和培養(yǎng)基在應(yīng)用前要用已知陽(yáng)性菌(如大腸埃希菌)和已知陰性菌(如克雷伯菌)做對(duì)照試驗(yàn)。 ⑵ MR試驗(yàn)的正確性取決于足夠的孵育時(shí)間，接種細(xì)菌后至少要孵育24h。通常每毫升培養(yǎng)物滴加1滴指示劑。[保存] 置4℃冰箱，培養(yǎng)基2周內(nèi)用完。甲基紅試劑置密閉的棕色瓶?jī)?nèi)，可使用3月。 [用途] 用于細(xì)菌靛基質(zhì)試驗(yàn)。 [配法] 蛋白胨(或胰蛋白胨)20g，氯化鈉5g，蒸餾水1L。將上述成分溶于水中，分裝試管，每管2~3m1，置121℃滅菌15min備用。附：試劑配制⑴ 靛基質(zhì)柯氏試劑：對(duì)二甲氨基苯甲醛5g溶于異戊醇75ml中，待冷卻后慢慢加入濃鹽酸25ml。⑵ 歐氏試劑：對(duì)二甲氨基苯甲醛1g溶于95%乙醇95ml中，溶解后慢慢加入濃鹽酸20m1。（3） 色氨酸滴板法試劑： （pH ）。[用法]將待檢菌接種培養(yǎng)基，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h，在培養(yǎng)物液面，徐徐加入靛基質(zhì)試劑數(shù)滴，陽(yáng)性者立即出現(xiàn)玫瑰紅色，陰性者呈黃色。 [質(zhì)量控制] 大腸埃希菌 ATCC25922 陽(yáng)性；肺炎克雷伯菌 陰性。[保存] 置4℃冰箱，使用期2周。注：⑴ 靛基質(zhì)試驗(yàn)方法還有試紙懸掛法，色氨酸滴板法及斑點(diǎn)法，請(qǐng)參閱有關(guān)資料。 ⑵ 選用的蛋白胨一定要含有豐富的色氨酸，否則不能應(yīng)用。⑶ 國(guó)內(nèi)多采用柯氏試劑。第六節(jié) 抗菌藥物敏感試驗(yàn)培養(yǎng)基抗菌藥物敏感試驗(yàn)用于測(cè)定抗菌藥物或其它抗微生物制劑在體外抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的能力。有瓊脂擴(kuò)散法和稀釋法兩種。WHO推薦改良KirbyBauer法抗菌藥物敏感試驗(yàn)，其技術(shù)簡(jiǎn)單，可重復(fù)性好，且特別適合快速生長(zhǎng)的致病菌。但其不適用于肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌和奈瑟菌的抗菌藥物敏感試驗(yàn)，這些的細(xì)菌須在常規(guī)的抗菌藥物敏感試驗(yàn)培養(yǎng)基內(nèi)補(bǔ)充特殊的營(yíng)養(yǎng)成分。一、MH瓊脂培養(yǎng)基 [用途] KirbyBauer法抗菌藥敏試驗(yàn)指定使用本培養(yǎng)基。MH瓊脂(MullerHinton瓊脂，水解酪蛋白瓊脂)加5 %羊血制成血瓊脂平板或制成巧克力瓊脂平板用于檢測(cè)肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌。 [配法] 牛肉浸出物1L，，瓊脂17g。 將上述各成分混合，靜置10min，待可溶物完全溶解后，121℃高壓15min滅菌。冷至50℃左右，吸取25m1培養(yǎng)基注入直徑90mm的平皿內(nèi)，制成厚度為4mm的瓊脂平板。 [質(zhì)量控制] 用質(zhì)控菌株測(cè)定藥物的抑菌環(huán)與NCCLS的標(biāo)準(zhǔn)參比判斷培養(yǎng)基的質(zhì)量。 常用的標(biāo)準(zhǔn)菌株有：金黃色葡萄球菌ATCC 25923；大腸埃希菌ATCC 25922；銅綠假單胞菌ATCC 27853；糞腸球菌 ATCC 29212或33186；肺炎鏈球菌ATCC 6305；流感嗜血桿菌ATCC l0211。 [保存] 瓊脂平板應(yīng)新鮮使用， 4℃冰箱保存，1周內(nèi)用完。注：⑴ 質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)NCCLS紙片法藥敏試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)。⑵ 在MH瓊脂培養(yǎng)基添加5 %脫纖維羊血，即可用于肺炎鏈球菌的抗菌藥物敏感試驗(yàn)。⑶ 在MH瓊脂培養(yǎng)基上，補(bǔ)充輔酶Ⅰ15mg/ml，牛血紅蛋白15mg/m1，酵母浸膏5mg/m1， U/m1，可用于流感嗜血桿菌的抗菌藥物敏感試驗(yàn)。(4) NCCLS推薦淋病奈瑟菌用GC瓊脂平板，添加生長(zhǎng)補(bǔ)充劑。生長(zhǎng)補(bǔ)充劑由下列試劑組成：，3mg硫胺，13mg對(duì)氨基苯甲酸， , ，Ⅰ,1mg嘌呤腺，10mg L谷氨酰胺，100mg葡萄糖。 二、MH肉湯培養(yǎng)基 [用途] 用于稀釋法細(xì)菌藥物敏感試驗(yàn)(MIC和MBC測(cè)定)。 [配法]牛肉浸湯600m1，，蒸餾水400ml。 將上述成分混合加熱溶解，校正pH 177。，121℃滅菌15min備用。如試驗(yàn)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高，%比例加入羊血。 [質(zhì)量控制] 質(zhì)控菌株同MH瓊脂培養(yǎng)基，凡自配或購(gòu)置商品培養(yǎng)基均需用質(zhì)控菌株和藥物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果符合方可使用。[保存] 置4℃冰箱2周內(nèi)用完。注：NCCLS推薦使用含陽(yáng)離子MH培養(yǎng)基，即在MH液體培養(yǎng)基中含有鈣離子10 ~25mg/L，鎂離子10 ~25mg/L。配法如下:，即為含鈣離子10mg/ml貯存液。，溶于100ml蒸餾水中，即為含鎂離子10mg/ml貯存液。第七節(jié) L型細(xì)菌培養(yǎng)基一、 L型細(xì)菌增菌培養(yǎng)基(一)高滲液體L型細(xì)菌菌增菌培養(yǎng)基[用途]可用作基礎(chǔ)培養(yǎng)。也用于血液、骨髓、胸水等標(biāo)本進(jìn)行L型細(xì)菌增菌培養(yǎng)。 [配法] 新鮮牛肉500g，蛋白胨10g,氯化鈉40g，蒸餾水1L。將新鮮牛肉去除脂肪、筋膜，切成小塊后用絞肉機(jī)絞碎，稱(chēng)取500g加水1L混合后置冰箱浸泡過(guò)夜；將肉浸液煮沸30min，然后用麻布或絨布擠壓過(guò)濾；加入蛋白胨、氯化鈉后加熱溶解，并補(bǔ)足因蒸發(fā)而失去的水分，~；用濾紙過(guò)濾后分裝小瓶，121℃滅菌15~20min。 [用途] 用于血液、骨髓、胸水等標(biāo)本的L型細(xì)菌增菌培養(yǎng)。[配法]新鮮牛肉500g，蛋白胨10g,氯化鈉30g，蔗糖150g，蒸餾水1L。同上述高滲鹽培養(yǎng)基，唯高壓蒸汽滅菌時(shí)采用115℃ 20min，以免蔗糖分解。[用法] 取血液5ml及其它標(biāo)本直接種于高鹽、高滲糖液體培養(yǎng)基，置35℃培養(yǎng)l~7 天，每天觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。在上述增菌培養(yǎng)基上， L型細(xì)菌呈顆粒狀生長(zhǎng)，顆?？烧掣接诠鼙诨虺恋碛诠艿?。 [質(zhì)量控制]金黃色葡萄球菌L型生長(zhǎng)良好。(二)L型增菌培養(yǎng)基[用途] 用于血液、腦脊液等體液標(biāo)本中L型細(xì)菌的增殖培養(yǎng)。 [配法] ⑴ 牛肉浸液1L,氯化鈉30~40g,蛋白胨(優(yōu)質(zhì))20g. ⑵ 牛肉浸液1L，氯化鈉30g，蔗糖150g，蛋白胨20g。 將各成分稱(chēng)量混合加熱溶解后，~，分裝培養(yǎng)瓶，每瓶15m1，121℃滅菌15min備用。[用法]用無(wú)菌操作采集標(biāo)本，立即接種于L型細(xì)菌液體培養(yǎng)基和常規(guī)血液增菌培養(yǎng)基內(nèi)，標(biāo)本與培養(yǎng)基之比為1︰10，置35℃培養(yǎng)3~7 天，逐日觀察。如發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液產(chǎn)生混濁、溶血、絮狀沉淀或瓶壁上附有粘性顆粒等細(xì)菌生長(zhǎng)現(xiàn)象，立即分離至L型細(xì)菌分離平板上進(jìn)行鑒定。 [質(zhì)量控制] 用L型細(xì)菌做生長(zhǎng)試驗(yàn)，培養(yǎng)24~72h，生長(zhǎng)良好。[保存] 置4℃冰箱內(nèi)使用l~2周。二、L型細(xì)菌分離瓊脂培養(yǎng)基[用途] 用于常見(jiàn)L型細(xì)菌的分離培養(yǎng)。 [配法] 牛肉浸液800m1，氯化鈉50g，蛋白胨(OXoid)20g，瓊脂粉(Oxoid)8g，血漿(人、馬、羊)200m1。將前四種成分稱(chēng)量混合加熱溶解，校正pH 177。，分裝每瓶80m1，121℃滅菌15min冷藏備用。臨用時(shí)加熱溶解后，冷卻至56℃加入血漿20ml搖勻傾注平板。放在密封塑料袋中，置4℃冰箱備用。 注：血漿要預(yù)先滅菌處理，并經(jīng)56℃水浴滅活30min。 2．蚌埠857分離平板 [配法] 牛肉浸液1L，氯化鈉40g，蛋白胨30g，明膠(生物試劑)30g，瓊脂粉5~8g。將上述成分混合，加熱溶解，校正pH ~，分裝后，經(jīng)121℃滅菌15min后傾注平板，置4℃冰箱備用。[用法]將血、腦脊液、用L型玻棒均勻涂開(kāi)，置35℃溫箱內(nèi)啟蓋片刻，除去平板表面水分。在平板的邊端貼一片專(zhuān)用誘導(dǎo)紙片。覆蓋后置35℃10 %二氧化碳環(huán)境下3~5 天，逐日觀察。如有可疑L型菌落，用低倍鏡檢查。在誘導(dǎo)區(qū)與非誘導(dǎo)區(qū)同時(shí)見(jiàn)到L型菌落