【正文】 培養(yǎng)基不能高熱滅菌，以防破壞其中營養(yǎng)成分。 (呂氏血清斜面)[用途] 用于白喉棒狀桿菌培養(yǎng)。再添放馬鈴薯粉，邊放邊攪，并繼續(xù)置沸水中加熱30min，待冷卻至60℃左右時(shí)，加入雞卵液1L及孔雀綠溶液20ml，充分混勻后，用無菌操作分裝于滅菌試管，每支5~6ml，塞緊橡皮塞（最好是翻口塞），置于血清凝固器內(nèi)制成斜面，經(jīng)85℃1h間歇滅菌2次(或高壓滅菌115℃20min)，待凝固后經(jīng)無菌試驗(yàn)，4℃冷藏備用。必要時(shí)做第二次增菌。傷寒沙門菌ATCC 5009福氏志賀菌ATCC 12022 生長良好；大腸埃希菌ATCC 25922 生長抑制。 ⑶ 在制備過程中，亞硒酸鹽不能直接加熱。如發(fā)現(xiàn)均勻混濁，管底有紅色沉淀物，表示細(xì)菌生長。 [用途] 沙門菌增菌培養(yǎng)。 ⑵ 對(duì)氨基苯甲酸主要中和血液中磺胺類藥物的抑菌作用。 [配法] 蛋白胨(或月示 胨)10g，氯化鈉5g，肉浸液（或心浸液）1L，葡萄糖3g，枸櫞酸鈉3g，5g/L對(duì)氨基苯甲酸水溶液10ml，1mol/L硫酸鎂溶液20ml，青霉素酶1000 U。分裝試管，115℃滅菌15min。 [配法] 鮮牛肉浸出液1L， 蛋白胨10g,氯化鈉5g，瓊脂粉12g，無菌脫纖維羊血或兔血100ml。 [質(zhì)量控制] 金黃色葡萄球菌菌落呈淺黃色； 痢疾志賀菌菌落無色；銅綠假單胞菌 菌落無色或淺綠色。[用法]根據(jù)用途不同可以制成營養(yǎng)肉湯，以此為基礎(chǔ)制成其它培養(yǎng)基。經(jīng)121℃滅菌15min，作無菌試驗(yàn)后冷藏備用。⑴ 印度墨汁或50g/L黑色素水溶液⑵ 5g/L苯胺藍(lán)水溶液。②1g/L金胺O液：,再加入純石炭酸 5ml,混勻。將碘與碘化鉀混合并研磨,加入幾毫升蒸餾水, 使其逐漸溶解,然后研磨,繼續(xù)加入少量蒸餾水至碘、碘化鉀完全溶解。二、診斷用血清⑴ AF群O多價(jià)診斷血清。微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用試劑與培養(yǎng)基 29 / 29第一節(jié) 常用試劑及其使用方法一、診斷用紙片⑴ 桿菌肽紙片（）：抑菌圈10mm為敏感。⑵ 特異O群因子診斷血清：常用的有O2，O4，O7，O9，O10診斷血清。最后補(bǔ)足水量。③3%鹽酸乙醇。第二節(jié) 基礎(chǔ)培養(yǎng)基一、液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基[用途]用于細(xì)菌靛基質(zhì)試驗(yàn)；一般細(xì)菌培養(yǎng)和傳代。 [質(zhì)量控制] 金黃色葡萄球菌、傷寒沙門菌、化膿性鏈球菌生長良好。如制作固體培養(yǎng)基，加入瓊脂15 ~20g/L即可。[保存] 置4℃冰箱保存，2周內(nèi)用完。將上述成分（除兔血外）加熱溶解，置121℃15min高壓滅菌，待冷至約85℃，以無菌方式加入兔血，搖勻后置85℃水浴中，維持該溫度10min，使之成巧克力色。[用法]用于測(cè)定糖發(fā)酵時(shí)，按需要加入各種糖溶液，將待檢標(biāo)本直接種于培養(yǎng)基管內(nèi)，置35℃孵箱，18~24h觀察結(jié)果。 將蛋白胨、氯化鈉混合于肉浸液中加熱溶解，再加入葡萄糖、枸櫞酸鈉、對(duì)氨苯甲酸及硫酸鎂，繼續(xù)煮沸5min，并補(bǔ)足失水。 ⑶ 硫酸鎂主要抑制血液中存在的四環(huán)素、金霉素、新霉素、多粘菌素及鏈霉素的抑菌作用。 [配法] 蛋白胨5g，乳糖4g，亞硒酸氫鈉4g，蒸餾水1L。然后取培養(yǎng)物分離在選擇性培養(yǎng)基上，如SS瓊脂、麥康凱瓊脂平板等，進(jìn)行培養(yǎng)。隔水煮沸時(shí)間亦不能超過規(guī)定時(shí)間，否則亞硒酸鹽會(huì)變質(zhì)，生成紅色沉淀物。注：⑴ 切勿高壓，隔水煮沸時(shí)間不超過5min。[質(zhì)量控制] 有條件的實(shí)驗(yàn)室可用標(biāo)準(zhǔn)菌株，一般臨床實(shí)驗(yàn)室可用非01群弧菌，培養(yǎng)后生長良好者方可使用。[用法] 取晨咳痰或其它體液標(biāo)本，（約2滴）滴種于培養(yǎng)基的斜面上，盡量搖晃，置35℃5%~10%二氧化碳溫箱內(nèi)培養(yǎng)1~4周，觀察結(jié)果。[配法]1%葡萄糖肉湯(pH )100ml，無菌動(dòng)物血清(牛、羊、豬、兔) 300ml。⑶ 配制時(shí)所有器皿、棉塞等均應(yīng)高壓滅菌。 二、革蘭陰性桿菌分離培養(yǎng)基 (一)弧菌分離培養(yǎng)基 [用途] 用于霍亂弧菌分離培養(yǎng)。ELTor弧菌生長良好；大腸埃希菌ATCC 25922 生長抑制。其它細(xì)菌菌落小而凸起，不透明，或有色素。 由于該培養(yǎng)基抑制性強(qiáng)，其它非弧菌科細(xì)菌被抑制，而霍亂弧菌生長迅速，16h菌落可達(dá)2mm，菌落青灰色，半透明，扁平，光滑濕潤。 [配法] 蛋白胨10g，氯化鈉5g，牛肉浸膏3g，亞硫酸鈉(無水)3g，枸櫞酸鈉10g，豬膽汁粉5g，十二烷硫酸鈉20g，利凡諾（雷佛奴爾）3g，瓊脂粉12g，慶大霉素亞碲酸鉀混合液 1ml，蒸餾水1L。成品培養(yǎng)基應(yīng)避光保存。[保存] 4℃冰箱保存，1周內(nèi)用完。將上述成分(酚紅除外)混合，加熱溶解，,再加入酚紅溶液混勻。將上述成分(除中性紅、煌綠外)混合于水中，加熱煮沸溶解，~，然后加入中性紅和煌綠溶液，充分混勻冷卻至50℃時(shí)傾注平板。將上述成分(除中性紅外)稱量加入水中，加熱溶解，加入中性紅溶液，分裝滅菌115℃20min，冷卻至50℃左右時(shí)傾注平板。將蛋白胨、磷酸鹽、瓊脂稱量混合于水中，并加熱煮沸溶解，校正pH至 ，分裝121℃滅菌15min備用。將前8種成分稱量混合于水中，加熱溶解，再加入瓊脂和酚紅溶液，煮沸溶解分裝試管，每管4ml，經(jīng)115℃滅菌20min，立即制成高層斜面，待凝固后經(jīng)無菌試驗(yàn)備用。 [用途] 用于腸桿菌科細(xì)菌初步生化鑒定。分解乳糖或蔗糖后產(chǎn)氣時(shí)有些菌株還能使培養(yǎng)基斷裂。臨用時(shí)，加熱溶解，再加山梨醇、結(jié)晶紫及中性紅溶液，搖勻傾注平板。將上述成分加熱、溶解，分裝試管，118~121℃滅菌15min，制成斜面和高層備用。置35℃孵箱培養(yǎng)24~48h。另外分別配新鮮L半胱氨酸溶液（）及焦磷酸鐵溶液（），分別過濾除菌，再加入已滅菌瓊脂中， 加入1mol/L 氫氧化鉀溶液4～～，可用1mol/L 鹽酸溶液校正，傾注平板，冷卻后置4℃冰箱備用，亦可制成斜面，用于保存菌種。待冷至50℃，搖勻，傾注無菌平板。3）彎曲菌運(yùn)送可用布氏菌湯培養(yǎng)基。 將上述成分混合后，加熱溶解。先取血清25ml、蒸餾水75ml混合，置阿諾滅菌器內(nèi)加熱15min，以破壞血清內(nèi)的淀粉酶。將上述成分混合加熱溶解，分裝試管，115℃滅菌15min。加熱慢慢溶解，按10g/L濃度加入所需要的氨基酸，呈深亮紫色。 [用途] 用于檢測(cè)細(xì)菌所產(chǎn)生的耐熱脫氧核糖核酸酶。[配法]DNA 2g，胰酪胨15g，大豆胨5g，氯化鈉5g，瓊脂20g，蒸餾水1L。 [配法]鹽酸二甲基對(duì)苯二胺（或四甲基對(duì)苯二胺）。將前5種成分混合于蒸餾水中，加熱溶解，然后加入酚紅溶液，分裝每瓶100ml，經(jīng)121℃滅菌15min備用。用于區(qū)別葡萄球菌有無致病性，致病性葡萄球菌呈陽性。 ⑵ 以上為酸性磷酸酶的試驗(yàn)方法。將馬尿酸鈉和肉湯（pH ）加熱溶解后分裝于試管中，每管4ml， 121℃滅菌15min。而茚三酮?jiǎng)t生成還原型茚三酮。將試劑甲、乙分別置121℃滅菌15min，冷至40~50℃左右，試劑乙加入0NPG ，置56℃水浴中加熱溶解，無菌過濾，將過濾液與試劑甲液合并分裝試管，每管2m1，做無菌試驗(yàn)后備用。除瓊脂外其它的成分加熱溶解，再加入瓊脂溶解后，分裝，每管約4m1，高壓滅菌121℃15min，置成斜面，凝固后4℃冰箱保存，備用。 [配法] 蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，瓊脂(肉場(chǎng)培養(yǎng)基中不加)20g，氯化鈉5g，蒸餾水1L，可溶性淀粉20g，小牛血清 50ml。置35℃孵育。 ⑵ 。[用法] 取試驗(yàn)菌株18~24h肉湯培養(yǎng)物1環(huán)接種培養(yǎng)基。培養(yǎng)基由綠色變藍(lán)色為陽性，培養(yǎng)基為綠色或黃色(僅葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸)為陰性。培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色為陽性。取待檢菌大量接種培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)24~48h,加斑氏試劑1ml，充分混勻，隔水加熱煮沸10min，觀察結(jié)果。[保存] 置4℃冰箱，2周內(nèi)用完。將各成分溶于水中，校正pH ，分裝，116℃滅菌15min。四、其它生化試驗(yàn)培養(yǎng)基[用途] 腸桿菌科細(xì)菌均能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，如銅綠假單胞菌能還原硝酸鹽并可產(chǎn)生氮?dú)獾?，而有些?xì)菌則無此特性，故可以此鑒別。注：⑴ 因亞硝酸鹽在自然界中分布很廣，制備此培養(yǎng)基時(shí)所用器皿均要清洗干凈。[用途] 測(cè)定細(xì)菌還原亞硝酸鹽的能力。 [質(zhì)量控制]銅綠假單胞菌 ATCC 27853陽性。[用法] 取待檢標(biāo)本接種肉湯，置35℃培養(yǎng)24~48h，觀察有無細(xì)菌生長。在兩種細(xì)菌劃線之交接處出現(xiàn)箭頭形透明溶血區(qū)為陽性。[用途] 觀察細(xì)菌產(chǎn)生硫化氫的作用。 將上述成分加熱溶解，分裝試管，每管3m1，115℃滅菌20min，備用。[用法]將被檢菌的肉湯培養(yǎng)物用無菌棉棒均勻涂布于血瓊脂平板上，取optochin紙片貼于平板上，35~37℃培養(yǎng)18~24h。每片濾紙含O/129 10μg。培養(yǎng)基有混濁物為陽性。 [保存] 置冰箱內(nèi)，1周用完。[用法]取18~24h培養(yǎng)物小量接種，35℃孵育24~48h，有時(shí)可能延長數(shù)天。觀察時(shí)按每2m1培養(yǎng)物加甲液lml，置35℃15~30min出現(xiàn)紅色為陽性，若無紅色，應(yīng)置35℃4h后再判定，本法較奧氏法敏感。 ⑷ 貝立脫方法是相當(dāng)敏感的，它可檢出以前認(rèn)為VP試驗(yàn)陰性的某些細(xì)菌。 [配法] ⑴ 葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基(見前)。 [用途] 用于細(xì)菌靛基質(zhì)試驗(yàn)。[保存] 置4℃冰箱，使用期2周。一、MH瓊脂培養(yǎng)基 [用途] KirbyBauer法抗菌藥敏試驗(yàn)指定使用本培養(yǎng)基。注：⑴ 質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)參見NCCLS紙片法藥敏試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)。121℃滅菌15min備用。也用于血液、骨髓、胸水等標(biāo)本進(jìn)行L型細(xì)菌增菌培養(yǎng)。 [質(zhì)量控制]金黃色葡萄球菌L型生長良好。二、L型細(xì)菌分離瓊脂培養(yǎng)基[用途] 用于常見L型細(xì)菌的分離培養(yǎng)。將上述成分混合，加熱溶解，校正pH ~，分裝后，經(jīng)121℃滅菌15min后傾注平板，置4℃冰箱備用。在平板的邊端貼一片專用誘導(dǎo)紙片。將前四種成分稱量混合加熱溶解，校正pH 177。 [配法] ⑴ 牛肉浸液1L,氯化鈉30~40g,蛋白胨(優(yōu)質(zhì))20g. ⑵ 牛肉浸液1L，氯化鈉30g，蔗糖150g，蛋白胨20g。將新鮮牛肉去除脂肪、筋膜，切成小塊后用絞肉機(jī)絞碎，稱取500g加水1L混合后置冰箱浸泡過夜；將肉浸液煮沸30min，然后用麻布或絨布擠壓過濾；加入蛋白胨、氯化鈉后加熱溶解，并補(bǔ)足因蒸發(fā)而失去的水分，~；用濾紙過濾后分裝小瓶，121℃滅菌15~20min。 [質(zhì)量控制] 質(zhì)控菌株同MH瓊脂培養(yǎng)基，凡自配或購置商品培養(yǎng)基均需用質(zhì)控菌株和藥物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果符合方可使用。⑶ 在MH瓊脂培養(yǎng)基上，補(bǔ)充輔酶Ⅰ15mg/ml，牛血紅蛋白15mg/m1，酵母浸膏5mg/m1， U/m1，可用于流感嗜血桿菌的抗菌藥物敏感試驗(yàn)。 [配法] 牛肉浸出物1L，瓊脂17g。 ⑵ 選用的蛋白胨一定要含有豐富的色氨酸，否則不能應(yīng)用。將上述成分溶于水中，分裝試管，每管2~3m1，置121℃滅菌15min備用。 [質(zhì)量控制] 大腸埃希菌ATCC 25922陽性；產(chǎn)氣腸桿菌陰性。實(shí)際上，腸桿菌科的大多數(shù)細(xì)菌產(chǎn)生相反的反應(yīng)（由于乙酰甲基甲醇形成堿性增加導(dǎo)致MR陰性和VP陽性）。[保存] 培養(yǎng)基置4℃冰箱，2周內(nèi)用完。若懷疑為哈夫尼亞菌時(shí)，可重復(fù)VP試驗(yàn)并在25℃孵育。 ⑵ 氰化鉀劇毒，使用時(shí)注意安全。 [用途] 主要用于屬間的鑒別，生長有：弗氏枸櫞酸桿菌、克雷伯菌腸桿菌菌群、銅綠假單胞菌；不生長：沙門菌亞利桑那菌群、大腸埃希菌、糞產(chǎn)堿桿菌。平板出現(xiàn)抑菌圈為陽性，無抑菌圈為陰性。 [質(zhì)量控制] 肺炎鏈球菌(ATCC l0015)陽性。培養(yǎng)基呈黑色為陽性，不變黑色為陰性。其適用于腸桿菌科以外的細(xì)菌所產(chǎn)生的少量硫化氫的檢測(cè)；而硫酸亞鐵法，為檢查硫化氫的常規(guī)培養(yǎng)基。 [質(zhì)量控制] 無乳鏈球菌ATCC l3813陽性；糞腸球菌 ATCC 29212陰性。 [質(zhì)量控制] 糞腸球菌ATCC 29212陽性；化膿鏈球菌ATCC l9615陰性。 [注意事項(xiàng)] ⑴ 因亞硝酸鹽在自然界中分布很廣，故在制備此培養(yǎng)基時(shí)所用器皿均要清洗干凈。分裝試管每管約4ml，加入小倒管1只，121℃滅菌15min后備用。 ⑶ 本試驗(yàn)在判定結(jié)果時(shí)，必須在加試劑后立即觀察，否則可因培養(yǎng)液迅速褪色而影響判定。上述成分混合后，加熱溶解。若有細(xì)菌生長即為陽性，反之為陰性。注：⑴ 當(dāng)挑取同一培養(yǎng)物接種一組生化試驗(yàn)管時(shí)，在接種枸椽酸鹽培養(yǎng)基前，接種針或環(huán)要用火焰滅菌，或先接種枸櫞酸鹽培養(yǎng)基。 [質(zhì)量控制] 肺炎克雷伯菌ATCC 27236陽性；大腸埃希菌ATCC 25922陰性。[保存] 置4℃冰箱，2周內(nèi)用完。 [質(zhì)量控制] 肺炎克雷伯菌ATCC 27236陽性； 丙二酸鹽陰性桿菌陰性。培養(yǎng)基呈黃色為陽性，表明細(xì)菌能利用粘液酸鹽；若培養(yǎng)基不變色則為陰性。⑷ 培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)不少于36h。將Lugol碘液直接加到孵育過的平板上，培養(yǎng)基呈深藍(lán)色，菌落周圍有透明圈為陽性，菌落周圍無透明圈為陰性。再將20g淀粉溶于250m1蒸餾水中。 [質(zhì)量控制] 普通變形桿菌ATCC l3315陽性；大腸埃希菌ATCC 25922陰性。培養(yǎng)基呈黃色者為陽性，不變黃色為陰性。 [用途] 用于