【正文】 亂弧菌的快速鑒定。 第五節(jié) 分子生物學(xué)技術(shù)在微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用 分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，拓展了微生物學(xué)檢驗(yàn)方面的應(yīng)用空間。該技術(shù)具有敏感、特異、安全和快速等特點(diǎn)，在微生物檢驗(yàn)中發(fā)揮著日益重要的作用。本節(jié)簡要介紹分子生物學(xué)技術(shù)在微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用，具體檢測方法參見有關(guān)專著或試劑盒說明書。 一、分子生物學(xué)技術(shù)在細(xì)菌分類中的應(yīng)用 細(xì)菌的傳統(tǒng)分類法和數(shù)值分類法以表型特征相似性為基礎(chǔ)，而單純表型相似性還不能準(zhǔn)確地確定系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。隨著分子生物學(xué)及遺傳學(xué)的發(fā)展，細(xì)菌分類學(xué)中發(fā)展了一系列核酸分析方法，包括DNA分子中G＋C百分含量測定、DNADNA雜交、16S rRNA相關(guān)度分析等。 1． DNA分子中G＋C百分含量的測定 細(xì)菌DNA G+C或A+T摩爾百分比能反映細(xì)菌間DNA分子同源程度，不同種屬間G+C mol%范圍在25%~ 75%之間，但同一種細(xì)菌G+C mol%相當(dāng)穩(wěn)定，不受菌齡、培養(yǎng)條件和其他外界因素影響，親緣關(guān)系越近的細(xì)菌，G+C mol%越相近，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的細(xì)菌G＋Cmol%也不同，但G＋Cmol%相同或近似其親緣關(guān)系不一定相近。最常用的測定方法是熱變性溫度法，其次是高效液相色譜法和浮力密度法。 2． DNADNA雜交 DNA雜交可得出DNA之間核苷酸順序的互補(bǔ)程度，從而推斷不同細(xì)菌基因組間的同源性。目前最常用的是復(fù)性速率法，變性DNA在溶液中復(fù)性（雜交）時，同源DNA的復(fù)性速率比異源DNA要快，同源性愈高，復(fù)性速率愈快。復(fù)性的過程也伴隨著260nm紫外吸收的減少，再通過分光光度計直接測定變性DNA在一定條件下的復(fù)性速率，最后用理論推導(dǎo)的公式來計算DNA之間的同源性。同一菌的復(fù)性率為100%，80%~90%同源為同一種內(nèi)同一亞種的細(xì)菌，60%~70%同源為同一種內(nèi)不同亞種的細(xì)菌，20%~60%同源則是同一屬中的不同菌種。這種方法還可對新菌種或表型性狀差別很小而難以肯定的菌株做出較可靠的判定，并可修正其他方法的分類和鑒定錯誤。 3．16S rRNA同源性分析 (1) rRNADNA雜交：變性rRNA與變性DNA混合時，rRNA與其互補(bǔ)的DNA鏈形成雜交雙鏈，rRNA分子與異源DNA雜交時，也能在其同源區(qū)形成互補(bǔ)雙鏈，這種雜交雙鏈的穩(wěn)定性與其同源性成正相關(guān)，適于細(xì)菌屬及屬上水平的分類研究?，F(xiàn)最常用的是硝酸纖維膜結(jié)合法。 (2)16S rRNA序列測定：rRNA分子具有高度保守性，在所有的細(xì)胞生物中都存在，在長期的進(jìn)化中，16S rRNA的總堿基數(shù)有所不同，保守的部分使不同序列很容易相互對齊進(jìn)行比較。1985年Lane等提出了改良的Sanger雙脫氧鏈終止法測定rRNA序列，以rRNA為模板，以一個或多個寡核苷酸鏈做引物（與rRNA分子上的一段保守區(qū)域互補(bǔ)的15~20個核苷酸），用反轉(zhuǎn)錄酶合成反轉(zhuǎn)錄DNA。隨著PCR技術(shù)的成熟，出現(xiàn)了利用PCR技術(shù)擴(kuò)增16S rRNA基因（rDNA），然后采用Sanger法分析rDNA序列的方法，該法比前者更方便。當(dāng)前的細(xì)菌分類要求測定16S rRNA基因的全序列來進(jìn)行比較。16S rRNA基因序列分析技術(shù)是建立系統(tǒng)分類的主要技術(shù)，有人建議DNA相關(guān)性≥70%，16S rRNA序列差異≤1%~%的細(xì)菌屬于同一種，這使細(xì)菌的種有一個穩(wěn)定和統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。 二、分子生物學(xué)技術(shù)在細(xì)菌鑒定中的應(yīng)用 十九世紀(jì)，細(xì)菌的鑒定主要依靠細(xì)菌的表型特征，因耗時長，往往耽誤了對疾病診斷與治療。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及在臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用，為微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室對細(xì)菌的快速鑒定，尤其是對難分離細(xì)菌的快速鑒定，提供了有利條件。目前在細(xì)菌鑒定中應(yīng)用的分子生物學(xué)技術(shù)主要有核酸探針和核酸擴(kuò)增技術(shù)等。 1．核酸探針技術(shù) 應(yīng)用核酸探針技術(shù)檢測病原微生物核酸是臨床診斷學(xué)的重大發(fā)展，其原理是用帶有酶、化學(xué)熒光物、放射性核素或生物素標(biāo)記的已知序列特定DN***段（稱為探針），在一定條件下，按堿基互補(bǔ)原則探針與待測標(biāo)本中的核酸雜交，通過對雜交信號的檢測，從而鑒定標(biāo)本中有無相應(yīng)的病原微生物基因及其分子大小。常用核酸探針技術(shù)有固相雜交（斑點(diǎn)雜交、原位雜交、Southern印跡、Northern印跡等。）和液相雜交技術(shù)。 核酸探針適用于直接檢出臨床標(biāo)本中的病原微生物，不受非病原微生物的影響，因此對某些尚不能分離培養(yǎng)或很難分離培養(yǎng)的微生物的檢測具有重要的意義。隨著探針標(biāo)記的不斷改進(jìn)，檢測試劑盒商品化，操作更簡便易行。 2． 核酸擴(kuò)增技術(shù) 核酸擴(kuò)增（又稱基因或DNA擴(kuò)增）技術(shù)是體外酶促合成DN***段的新方法，其原理類似于DNA的體內(nèi)半保留復(fù)制。主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個步驟反復(fù)的熱循環(huán)構(gòu)成。即在高溫下（95℃）下，待擴(kuò)增的靶DNA雙鏈?zhǔn)軣嶙冃猿蔀閮蓷l單鏈DNA模板；而后在低溫（37~55℃）情況下，兩條人式合成的寡核苷酸引物與互補(bǔ)的單鏈DNA模板結(jié)合，形成部分雙鏈；在Taq酶的最適溫度（72℃）下，以引物的3`端為合成的起點(diǎn)，以單核苷酸為原料，沿模板以5` 3`方向延伸，合成DNA新鏈。這樣每一雙鏈DNA模板，經(jīng)過一次解鏈、退火、延伸三個步驟的熱循環(huán)后就成了兩條雙鏈DNA分子。如此反復(fù)進(jìn)行，每一次循環(huán)所產(chǎn)生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板，每一次循環(huán)都使人工合成的引物間的DNA特異區(qū)段拷貝數(shù)擴(kuò)增一倍。經(jīng)過上述25~40個循環(huán)后，靶序列可以擴(kuò)增成106~108。 核酸擴(kuò)增技術(shù)（或稱聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，PCR）具有高敏感性、高特異性、簡便、快速等特點(diǎn)，臨床實(shí)驗(yàn)室常用PCR技術(shù)來檢測標(biāo)本中某些微生物，尤其是對難以培養(yǎng)微生物的檢測。其它用于檢測微生物的PCR技術(shù)還有：RTPCR、巢式PCR、多重PCR和隨機(jī)引物PCR等。核酸擴(kuò)增技術(shù)在臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用見表642。 表642 核酸擴(kuò)增技術(shù)在臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用 微生物種類 核酸擴(kuò)增技術(shù) 應(yīng) 用 金黃色葡萄球菌 多重PCR 對mecA基因檢測 凝固酶陰性葡萄球菌 多重PCR 對mecA基因檢測 肺炎鏈球菌 PCR 自溶酶和青霉素結(jié)合酶的檢測 化膿性鏈球菌 PCR M蛋白基因的菌株分型 淋病奈瑟菌 LCR 尿道分泌物標(biāo)本直接檢測 百日咳桿菌 PCR、巢式PCR 臨床標(biāo)本檢測 結(jié)核分枝桿菌 PCR、SDA、Qbeta 肺結(jié)核的診斷、呼吸道標(biāo)本檢測、臨床標(biāo)本直接檢測 鳥分枝桿菌復(fù)合群 PCR 鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌的區(qū)別 白喉棒狀桿菌 PCR 產(chǎn)毒菌株的檢測 腸致病性大腸埃希菌 多重PCR 產(chǎn)毒菌株檢測 傷寒、副傷寒沙門菌 PCR 耐藥質(zhì)粒分型和檢測 幽門螺桿菌 多重PCR 胃活檢組織細(xì)菌檢測 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌 PCR 菌株分型 彎曲菌屬 PCR 通過16s rRNA鑒定 杜克雷嗜血桿菌 多重PCR 生殖道潰瘍病人的直接檢測 嗜肺軍團(tuán)菌 PCR 與爆發(fā)相關(guān)菌株的分型 金氏桿菌屬 PCR 臨床標(biāo)本鑒定 念珠菌屬 PCR 通過“DNA”指紋鑒定 梅毒螺旋體 多重PCR 生殖道潰瘍標(biāo)本直接檢測 伯氏螺旋體 巢式PCR 治療前、中、后檢測 問號狀鉤端螺旋體 PCR 鉤端螺旋體血清型的鑒定 CDC group Ⅳ 群 PCR 分型 沙眼衣原體 PCR 無癥狀病人的診斷 三、分子生物學(xué)技術(shù)在細(xì)菌藥敏試驗(yàn)中的應(yīng)用 分子生物學(xué)技術(shù)在檢測耐藥基因方面日益受到重視。臨床上可用PCR方法檢測耐藥基因，來判斷待檢菌對某種抗菌藥物是否具有耐藥性。但某些沉默耐藥基因，如不表達(dá)相應(yīng)產(chǎn)物，則可能不表現(xiàn)耐藥表型?，F(xiàn)在已有檢測耐藥基因的DNA探針和PCR商品化試劑盒供應(yīng)，但多用于實(shí)驗(yàn)研究，常規(guī)工作中開展較少。目前能檢測的耐藥基因有： 1． β內(nèi)酰胺類 mecA、blaTEM、blaROBblaSHV、blaIMP、blaMIRblaOXA、blaPERblaPERblaOXYblaOXA10/11。 2． 氨基糖苷類 aph（3＇）—Ⅲ、aph（3＇）—Ⅵ、ant（2″）Ia、ant（4＇）Ia、aac（3） Ia、acc（6＇）Ia、aac（3）Va、aac（6＇）aph（2″）、ant（4＇）、ant（6’）Ia、aac（6＇）Ic、aac（3）Ib、aad（2″）Ia、ant（6）I、aph（2″）Ic。 3． 氯霉素 catP、catQ、catD、catI 4． 環(huán)內(nèi)酯類 ereA、ereB、ermA、ermAM、ermC、ermF、smp、mphA、mefA、vat。 5． 磺胺類 sulⅠ、sulⅡ,sulA。 6． 四環(huán)素 tet（A）、tet（C）、tet（D）、tet（K）、tet（L）、tet（M）、tet（O）、tet（P）、tet（S）、tet（Q）、tet（U）、tetA（P）。 7． 甲氧芐啶 dhfrⅠ、dhfrⅡ、dhfrⅢ、dhfrⅤ、dhfrⅦ、dhfrⅨ、dhfrⅩ、dfrA、folH、dhfrⅧ。 8．糖肽類 vanA、vanB、vanB2, vanCvanCvanD。 9．喹諾酮類 gyrA、gyrB、parE。 10．乙胺丁醇 embB。 11．吡嗪酰胺 pncA。 12．利福平 rpoB。 13．鏈霉素 rpsL、rrs。 14．異煙肼 katG、inhA、ahpC。 第六節(jié) 自動化技術(shù)在微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用 微生物鑒定的自動化技術(shù)近十幾年得到了快速發(fā)展。數(shù)碼分類技術(shù)集數(shù)學(xué)、計算機(jī)、信息及自動化分析為一體，采用商品化和標(biāo)準(zhǔn)化的配套鑒定和抗菌藥物敏感試驗(yàn)卡或條板，可快速準(zhǔn)確地對臨床數(shù)百種常見分離菌進(jìn)行自動分析鑒定和藥敏試驗(yàn)。目前自動化微生物鑒定和藥敏分析系統(tǒng)已在世界范圍內(nèi)臨床實(shí)驗(yàn)室中廣泛應(yīng)用。本節(jié)簡要介紹有關(guān)情況。 一、微生物數(shù)碼鑒定法 早在七十年代中期，一些國外公司就研究出借助生物信息編碼鑒定細(xì)菌的新方法。這些技術(shù)的應(yīng)用，為醫(yī)學(xué)微生物檢驗(yàn)工作提供了一個簡便、科學(xué)的細(xì)菌鑒定程序，大大提高了細(xì)菌鑒定的準(zhǔn)確性。目前，微生物編碼鑒定技術(shù)已經(jīng)得到普遍應(yīng)用，并早已商品化和形成獨(dú)特的不同細(xì)菌鑒定系統(tǒng)。如API、MicroID、RapID、Enterotube和Minitek等系統(tǒng)。這種鑒定系統(tǒng)是自動化鑒定系統(tǒng)的基礎(chǔ)。 ( 一)數(shù)碼鑒定法基本原理 數(shù)碼鑒定是指通過數(shù)學(xué)的編碼技術(shù)將細(xì)菌的生化反應(yīng)模式轉(zhuǎn)換成數(shù)學(xué)模式，給每種細(xì)菌的反應(yīng)模式賦予一組數(shù)碼，建立數(shù)據(jù)庫或編成檢索本。通過對未知菌進(jìn)行有關(guān)生化試驗(yàn)并將生化反應(yīng)結(jié)果轉(zhuǎn)換成數(shù)字（編碼），查閱檢索本或數(shù)據(jù)庫，得到細(xì)菌名稱。其基本原理是計算并比較數(shù)據(jù)庫內(nèi)每個細(xì)菌條目對系統(tǒng)中每個生化反應(yīng)出現(xiàn)的頻率總和。隨著電腦技術(shù)的進(jìn)步，這一過程已變得非常容易。 1．簡要介紹計算步驟： (1)出現(xiàn)頻率（概率）的計算：將記錄成陽性或陰性結(jié)果轉(zhuǎn)換成出現(xiàn)頻率：①對陽性特征，則除以100即得。②對陰性特征，除以100的商被1減去即可。③說明：對“0”和“100”，因這2個數(shù)太超量，為了使結(jié)果不出現(xiàn)過小或過大。 (2)在每一個分類單位中，將所有測定項(xiàng)目的出現(xiàn)頻率相乘，得出總出現(xiàn)頻率。 (3)在每個分類菌群中的所有菌的總出現(xiàn)頻率相加，除以一個分類單位的總出現(xiàn)頻率，乘100，即得鑒定%（%id） (4)在每個菌群中，再按%id值大小順序重新排列。將未知菌單次總發(fā)生頻率除以最典型反應(yīng)模式單次總發(fā)生頻率，得到模式頻率T值，代表個體與總體的近似值。T值越接近1，個體與總體越接近，鑒定價值越大。按%id大小排序，將相鄰兩項(xiàng)的%id之比為R，代表著首選條目與次選條目的差距，差距越大，價值越大。如果%id≥80，參考T及R值可作出鑒定。 2．在編碼檢索本中檢索數(shù)據(jù)譜得出的結(jié)果有以下幾種形式（以API鑒定系統(tǒng)為例）。 (1)有此數(shù)碼譜:①有一個或幾個菌名條目及相應(yīng)的鑒定值（%id和T值）。②對鑒定結(jié)果好壞的評價，最佳……等。③用小括號列出關(guān)鍵的生化結(jié)果及陽性百分率。④有時，鑒定結(jié)果不佳或有多條菌名條目,需進(jìn)一步補(bǔ)充試驗(yàn)項(xiàng)目才能得出良好的鑒定結(jié)果。⑤指出某些注意要點(diǎn)，需用“推測性鑒定”，并將此菌送至參考實(shí)驗(yàn)室；需用“血清學(xué)鑒定”，作進(jìn)一步的證實(shí)等。 (2)無此數(shù)碼譜：可能有以下原因：①此生化譜太不典型。②不能接受，鑒定值低(%id＜)。③可疑。需進(jìn)一步確認(rèn)是否純培養(yǎng)，重新鑒定，可與供應(yīng)商技術(shù)服務(wù)部聯(lián)系。 3. 結(jié)果解釋 (1)如果排序第一的細(xì)菌%id≥，則可將未知菌鑒定在此條目中，并按%id值的大小對鑒定的可信度作出評價。%id≥≥；%id ~，T≥；%id ~，T≥；%id ~。 (2)如果第一條目的%id＜，則將前2個條目的%id加在一起，則將前3個%id相加。若≥，則有2種可能：①為同種細(xì)菌，可能是不同生物型。②為同一菌屬的不同種。 如果相加的幾個條目既不屬于同一細(xì)菌種，又不屬于同一細(xì)菌屬，在評價中會指出“補(bǔ)充生化反應(yīng)”的項(xiàng)目及陽性反應(yīng)率，可通過這些生化反應(yīng)將幾種菌區(qū)分開來。若前3個條目的和＜，則為不可接受的結(jié)果。 (二)數(shù)碼鑒定在臨床上的應(yīng)用 國內(nèi)外已有許多種用于臨床細(xì)菌鑒定的數(shù)碼鑒定系統(tǒng)，為臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室對細(xì)菌的鑒定提供了簡便、快速的方法。目前常見微生物鑒定系統(tǒng)見表643 表643 目前常見微生物鑒定系統(tǒng) 生產(chǎn)廠商 系統(tǒng)名稱 可鑒定的微生物 孵育時間及條件 BioMerieux ANI 厭氧菌 ４h；需氧 API20A 厭氧菌 2４h；厭氧 API AnIDENT 厭氧菌 ４h；需氧 API Staph（STAPH－Trac） 葡萄球菌、微球菌 2４h GPI 革蘭陽性球菌和桿菌 2~15h ID32 Staph 葡萄球菌 24h API Coryne(Rapid CORYNE) 棒狀桿菌及相關(guān)菌 24h API 20Strep(Rapid STREP) 鏈球菌、腸球菌 ４~24h API 20E 腸桿菌科、非發(fā)酵菌 2４~48h EPS (Enteric Pathogen Screen） 愛德華菌屬、沙門菌屬、志