【文章內(nèi)容簡介】 (2) 方法：將待檢菌接種于試驗培養(yǎng)上，置35℃孵箱孵育1~4d，觀察結(jié)果。 (3) 結(jié)果：溴甲酚紫指示劑呈紫色為陽性，酚紅指示劑呈紅色為陽性。黃色為陰性。 (4) 應(yīng)用：主要用于腸桿菌科及假單胞菌屬的鑒定。 7．尿素酶試驗 (1)原理：某些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，分解尿素產(chǎn)生大量的氨，使培養(yǎng)基變堿。 (2)方法：將待檢菌接種于含有尿素的培養(yǎng)基中，35℃孵育18~24h，觀察結(jié)果。 (3)結(jié)果：紅色為陽性，不變?yōu)殛幮浴?(4)應(yīng)用：主要用于腸桿菌科變形桿菌屬、普羅威登菌屬、克雷伯菌屬及假單胞菌屬的鑒定。 8．霍亂紅試驗 (1)原理：霍亂弧菌分解色氨酸生成吲哚，并能使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，當(dāng)加入硫酸后生成亞硝酸吲哚，呈紅色反應(yīng)。 (2)方法：將待檢菌接種于蛋白胨水中，置35℃孵育24h，加入濃硫酸數(shù)滴，觀察結(jié)果。 (3)結(jié)果：呈紅色者為陽性。 (4)應(yīng)用：霍亂弧菌呈陽性反應(yīng)，但本試驗并非霍亂弧菌所特有。凡能產(chǎn)生吲哚并還原硝酸鹽為亞硝酸鹽的細(xì)菌，均可呈現(xiàn)陽性反應(yīng)。 三、碳源和氮源利用試驗 1．枸櫞酸鹽利用試驗 (1)原理：某些細(xì)菌能利用枸櫞酸鹽作為唯一碳源，而在此培養(yǎng)基上生長，并分解枸櫞酸鹽生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿性。 (2)方法：將待檢菌接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上，置35℃孵育1~4d，逐日觀察結(jié)果。 (3)結(jié)果：若用溴麝香草酚蘭指示劑，斜面出現(xiàn)菌落或菌苔，培養(yǎng)基變藍(lán)色為陽性；無菌落生長，培養(yǎng)基綠色為陰性。 (4)應(yīng)用：可用此試驗作細(xì)菌種屬間鑒定。埃希菌屬、志賀菌屬、愛德華菌屬和耶爾森菌屬均為陰性，沙門菌屬、克雷伯菌屬通常陽性，粘質(zhì)和液化沙雷菌和某些變形桿菌及枸櫞酸桿菌陽性。此外，銅綠假單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌和嗜水氣單胞菌也能利用枸櫞酸鹽。 2．丙二酸鹽利用試驗 (1)原理：某些細(xì)菌能利用丙二酸鹽作為唯一碳源，丙二酸鹽被分解生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿。 (2)方法：將待檢菌接種于丙二酸鹽培養(yǎng)基中，置35℃孵育24~48h，觀察結(jié)果。 (3)結(jié)果：培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色為陽性。顏色無變化為陰性。 (4)應(yīng)用：腸桿菌科中亞利桑那菌和克雷伯菌屬為陽性，枸櫞酸桿菌屬、腸桿菌屬和哈夫尼亞菌屬有不同生物型反應(yīng)，其它各菌屬均為陰性。 3．醋酸鈉利用試驗 (1)原理：細(xì)菌利用銨鹽作為唯一氮源，同時，利用醋酸鹽作為唯一碳源時，可在醋酸鹽培養(yǎng)上生長，分解醋酸鹽生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性。 (2)方法：將被檢菌接種于醋酸鹽培養(yǎng)基中，置35℃孵育2~7d，逐日觀察結(jié)果。 (3)結(jié)果：培養(yǎng)基上有細(xì)菌生長，并變?yōu)樗{(lán)色為陽性。 (4) 應(yīng)用：主要用于大腸埃希菌和志賀菌屬的鑒別，前者為陽性，而后者為陰性。 4．馬尿酸鈉水解試驗 (1)原理：某些細(xì)菌可具有馬尿酸水解酶，可使馬尿酸水解為苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸與三氯化鐵試劑結(jié)合，形成苯甲酸鐵沉淀。 (2)方法：將待檢菌接種于馬尿酸鈉培養(yǎng)基中，置35℃孵育48h，離心沉淀，，立即混勻，經(jīng)10~15min觀察 結(jié)果。 (3)結(jié)果：出現(xiàn)恒定之沉淀物為陽性。 (4) 應(yīng)用：主要用于B群鏈球菌的鑒定。 乙酰胺利用試驗 (1)原理：許多非發(fā)酵菌產(chǎn)生一種脫酰胺酶，可使乙酰胺經(jīng)脫酰胺作用釋放氨，使培養(yǎng)基變堿。 (2)方法：將被檢菌接種于乙酰胺培養(yǎng)基中，置35℃孵育24~48h，觀察結(jié)果。 (3)結(jié)果：培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色為陽性。如不生長，或稍有生長，但培養(yǎng)基顏色不變?yōu)殛幮浴?(4)應(yīng)用：主要用于非發(fā)酵菌的鑒定。銅綠假單胞菌、去硝化產(chǎn)堿桿菌、食酸假單胞菌為陽性，其它非發(fā)酵菌大多數(shù)為陰性。 四、酶類試驗 (1)原理：氧化酶又稱細(xì)胞色素氧化酶，是細(xì)胞色素氧化酶系統(tǒng)中的最終呼吸酶。此酶并不直接與氧化酶試劑起反應(yīng)，而是先使細(xì)胞色素C氧化，然后 此氧化型細(xì)胞色素C再使對苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。因此，本試驗結(jié)果與細(xì)胞色素C的存在有關(guān)。 (2)方法：取潔凈濾紙條，沾取菌落少許，加氧化酶試劑（10g/L鹽酸四甲基對苯二胺水溶液或10g/L鹽酸二甲基對苯二胺水溶液）1滴，1min內(nèi)觀察結(jié)果。也可將試劑滴加到菌落上進(jìn)行試驗。 (3)結(jié)果：陽性者立即變粉紅色，5~10s內(nèi)呈深紫色。無色為陰性。 (4)應(yīng)用：用于奈瑟菌屬的菌種鑒定，該屬細(xì)菌均陽性。此外，也用于假單胞菌屬與腸桿菌科細(xì)菌的區(qū)別，前者陽性，而后者陰性。莫拉菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬等均為陽性。 注意事項： ①試驗時應(yīng)避免接觸含鐵物質(zhì)，以免出現(xiàn)假陽性。②10g/L鹽酸四甲基對苯二胺或10g/L鹽酸四甲基對苯二胺水溶液為無色溶液，在空氣中易被氧化而失效，故應(yīng)經(jīng)常更換新試劑，并盛于棕色瓶中，若試劑已變成深藍(lán)色，應(yīng)棄去不用。 2．觸酶試驗 (1)原理：觸酶又稱過氧化氫酶，具有過氧化氫酶的細(xì)菌，能催化過氧化氫成為水和原子態(tài)氧，繼而形成氧分子，出現(xiàn)氣泡。 (2)方法：取潔凈玻片1張，用接種環(huán)挑取細(xì)菌，加3％H2O2 1滴，立即觀察結(jié)果。 (3)結(jié)果：若立即出現(xiàn)大量氣泡為陽性。無氣泡為陰性。 (4)應(yīng)用：大多需氧和兼性厭氧菌均產(chǎn)生過氧化氫酶，但鏈球菌科陰性，故常用此試驗來鑒定。此外，金氏桿菌屬的細(xì)菌也為陰性。分枝桿菌的鑒別則用耐熱觸酶試驗，結(jié)核分枝桿菌為陰性，戈氏分枝桿菌和地分枝桿菌為陽性。 注意事項：①3％H2O2溶液要新鮮配制。②不宜用血瓊脂平板上生長的菌落，因紅細(xì)胞含有觸酶，可致假陽性反應(yīng)，③取對數(shù)生長期的細(xì)菌。 3．凝固酶試驗 (1)原理：凝固酶試驗是鑒定葡萄球菌致病性的重要試驗。致病性葡萄球菌可產(chǎn)生兩種凝固酶，一種是與細(xì)胞壁結(jié)合的凝聚因子，稱結(jié)合凝固酶，它直接作用于血漿中纖維蛋白原，使發(fā)生沉淀，包圍于細(xì)菌外面而凝聚成塊，玻片法陽性結(jié)果是由此凝聚因子所致；另一種凝固酶是分泌至菌體外，稱為游離凝固酶，它能使凝血酶原變成凝血酶類產(chǎn)物，使纖維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白，從而使血漿凝固。試管法可同時測定結(jié)合型和游離型凝固酶。 (2)方法: ①玻片法：在一張潔凈玻片中央加1滴生理鹽水，用接種環(huán)取待檢培養(yǎng)物與其混合（設(shè)陽性和陰性對照）制成菌懸液，若經(jīng)10~20s內(nèi)無自凝 現(xiàn)象發(fā)生，則加入人或兔新鮮血漿1環(huán)，與菌懸液混合，觀察結(jié)果。②試管法：于試管內(nèi)加1﹕，再加1~2個待試菌菌落，置37℃水浴，每30min觀察1次結(jié)果。 (3)結(jié)果：①玻片法：5~10s內(nèi)出現(xiàn)凝集者為陽性。②試管法：如有凝塊或整管凝集出現(xiàn)為陽性。2h后無上述現(xiàn)象出現(xiàn)，則放置過夜后再觀察。 (4)應(yīng)用：本試驗僅用于致病性葡萄球的鑒定。 注意事項：①玻片法為篩選試驗，陽性、陰性均需進(jìn)行試管法測定。②血漿必須新鮮。③應(yīng)使用肝素而非枸櫞酸鹽作抗凝劑抗凝的血漿。④本試驗也可用市購的膠乳凝集試驗試劑盒測定。 4．DNA酶試驗 (1)原理： 某些細(xì)菌能產(chǎn)生DNA酶，水解外源性DNA使之成為寡核苷酸。DNA可被酸沉淀，而寡核苷酸則不會。故在DNA瓊脂平板上加鹽酸后，可在 菌落周圍形成透明區(qū)。 (2)方法：在DNA瓊脂平板上點種待檢菌，35℃孵育18~24h，用1 mol/L鹽酸傾注平板，觀察結(jié)果。 (3)結(jié)果：如菌落周圍有透明區(qū)者為陽性，無透明區(qū)為陰性。 (4)應(yīng)用：主要用于腸桿菌科及葡萄球菌屬某些菌種的鑒定。沙雷菌、變形桿菌和金黃色葡萄球菌DNA酶均陽性。 5．膽汁溶菌試驗 (1)原理：膽汁或去氧膽酸鈉能導(dǎo)致某些細(xì)菌溶解，一方面是由于膽汁或去氧膽酸鈉降低了細(xì)菌細(xì)胞膜上的表面張力，使細(xì)菌的細(xì)胞膜破損或使菌體裂 解。另一方面可能與激活細(xì)菌體內(nèi)的自溶酶有關(guān)。 (2)方法：①試管法：用純培養(yǎng)物制備1ml生理鹽水濃菌懸液，分裝兩支試管。 100g/L去氧膽酸鈉為試驗 管。35℃孵育每小時觀察1次結(jié)果。②平板法：在血平板上選取單個可疑菌落，作好標(biāo)記，直接在菌落上加1接種環(huán)20g/L去氧膽酸鈉（），置35℃孵育30min（平板不要翻轉(zhuǎn)）觀察結(jié)果。 (3)結(jié)果：①試管法：在3h內(nèi)液體透明為陽性。②平板法：如菌落消失，僅留下溶血區(qū)為陽性，菌落不消失為陰性。 (4)應(yīng)用：用于肺炎鏈球菌的鑒定。 6．硝酸鹽還原試驗 (1)原理：硝酸鹽還原反應(yīng)包括兩個過程，其一是在合成代謝過程中，硝酸鹽還原為亞硝酸鹽和氨，再由氨轉(zhuǎn)化為氨基酸和細(xì)胞內(nèi)其它含氮化合物；另一是在分解代謝過程中，硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧作為呼吸酶系統(tǒng)中的終末受氫體。硝酸鹽還原過程可因細(xì)菌不同而異。有的細(xì)菌僅使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，如大腸埃希菌等；有的細(xì)菌可使其還原為亞硝酸鹽和離子態(tài)的銨；有的細(xì)菌能使硝酸鹽或亞硝酸鹽還原為氮，如沙雷菌屬；有的細(xì)菌還可以將其還原產(chǎn)物在合成性代謝中完全利用。硝酸鹽或亞硝酸鹽如果還原生成氣體的終末產(chǎn)物如氮或氧化氮，則稱為脫硝化或脫氮化作用。某些細(xì)菌能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與醋酸作用，生成亞硝酸，亞硝酸與試劑中的對氨基苯磺酸作用生成重氮基苯磺酸，后者與α萘胺結(jié)合生成Nα萘胺偶苯磺酸。 (2)方法：將待檢菌接種于硝酸鹽培養(yǎng)基（內(nèi)含小倒管）中，35℃孵育1~4d。將甲、乙等量混合液（用時混合），立即或10min內(nèi)觀察結(jié)果。 (3)結(jié)果：出現(xiàn)紅色為陽性反應(yīng)。如欲觀察有無氮氣產(chǎn)生，可于培養(yǎng)基管內(nèi)加1只小倒管，有氣泡產(chǎn)生，則表示有氮氣生成。如欲檢查培養(yǎng)基中硝酸鹽是否被分解，可取鋅粉少許加入培養(yǎng)基內(nèi)，如出現(xiàn)紅色表明硝酸鹽仍存在；若不出現(xiàn)紅色，表示硝酸鹽已被分解。 (4)應(yīng)用：本試驗廣泛用于細(xì)菌鑒定。腸桿菌科細(xì)菌均能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽；假單胞菌屬中有的細(xì)菌能產(chǎn)生氮氣，如銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、斯氏假單胞菌，有的則能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，如鼻疽假單胞菌等；厭氧菌如韋榮菌也能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽。 7．卵磷脂酶試驗 (1)原理：細(xì)菌產(chǎn)生的卵磷脂酶，經(jīng)鈣離子作用，能迅速分解卵黃或血清中的卵磷脂形成混濁沉淀狀的甘油酯和水溶性磷酸膽堿。 (2)方法：取待檢菌劃線接種或點種在卵黃瓊脂平板上，置35℃孵育3~6h，觀察結(jié)果。 (3)結(jié)果：3h后在菌落周圍形成乳白色混濁，即為卵磷脂酶試驗陽性，6h后該混濁圈可擴(kuò)大到直徑5~6mm。 (4) 應(yīng)用：該試驗主要用于厭氧的鑒定。產(chǎn)氣莢膜梭菌和諾維梭菌為陽性，其他梭菌為陰性。蠟樣芽孢桿菌亦為陽性。 8．磷酸酶試驗 (1)原理：磷酸酶是磷酸脂的水解酶，可使單磷脂水解，其反應(yīng)可根據(jù)反應(yīng)基質(zhì)不同而異，如用磷酸酚酞為基質(zhì)，經(jīng)磷酸酶水解后可釋放酚酞，在堿性環(huán)境中呈紅色。 (2)方法：取待檢菌接種于磷酸酚酞瓊脂平板上，置35℃孵育18~24h，于平皿蓋內(nèi)加1滴濃氨水，熏蒸片刻，觀察結(jié)果。亦可用液體培養(yǎng)基，經(jīng)孵育后，向管內(nèi)加400g/L氫氧化鈉溶液1滴，觀察結(jié)果。 (3)結(jié)果：菌落變?yōu)榧t色者為陽性。 (4)應(yīng)用：主要用于致病性葡萄球菌與非致病性葡萄球菌的鑒別，前者為陽性，后者為陰性。 9．脂酶試驗 (1)原理：細(xì)菌產(chǎn)生的脂酶可分解脂肪為游離脂肪酸。在培養(yǎng)基中加入維多利亞藍(lán)可與脂肪結(jié)合成為無色化合物，如果脂肪被分解，則維多利亞藍(lán)釋出，呈藍(lán)色。 (2)方法：將待檢菌接種于含維多利亞藍(lán)的脂酶培養(yǎng)基中，置35℃孵育24h，觀察結(jié)果。 (3)結(jié)果：培養(yǎng)基變?yōu)樯钏{(lán)色者為陽性，否則可呈無色或粉紅色。 (4)應(yīng)用：主要用于厭氧菌鑒定。在擬桿菌中產(chǎn)黑色素擬桿菌中間亞種產(chǎn)生脂酶，其它擬桿菌陰性；在梭菌屬中諾維梭菌和產(chǎn)芽胞梭菌也產(chǎn)生此酶，其它梭菌為陰性。 10．CAMP試驗 (1)原理：B群鏈球菌（無乳鏈球菌）產(chǎn)生一種“CAMP”因子，此種物質(zhì)能促進(jìn)葡萄球菌的β溶血素的活性。因此，可在兩種細(xì)菌的交界處溶血力增強，出現(xiàn)箭頭型透明溶血區(qū)。 (2)方法：在羊血或馬血瓊脂平板上，先以β溶血的金黃色葡萄球菌劃一橫線接種。再將待檢菌與前一劃線作垂直接種，兩者應(yīng)相距1cm，于35℃孵育18~24h，觀察結(jié)果。每次試驗應(yīng)做陰陽性對照。 (3)結(jié)果：兩種細(xì)菌劃線交接處出現(xiàn)箭頭型溶血區(qū)為陽性。 (4)應(yīng)用：主要用于B群鏈球菌（陽性）的鑒定，其他鏈球菌均為陰性。 11．石蕊牛乳試驗 (1)原理：由于牛乳內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)和糖類，各種細(xì)菌對這些物質(zhì)的分解能力不同，故可有數(shù)種不同反應(yīng)，用以鑒別細(xì)菌。 (2)將待檢菌接種于石蕊牛乳培養(yǎng)基中，若為芽胞梭菌，要在培養(yǎng)基中加入無菌鐵末，置35℃孵育18~24h，必要時可延長至14d。觀察結(jié)果。 (3)結(jié)果：①產(chǎn)酸：發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，使指示劑變?yōu)榉奂t色。②產(chǎn)氣：發(fā)酵乳糖而同時產(chǎn)氣，可沖開上面的凡士林。③凝固：因產(chǎn)酸太多而使牛乳中的酪蛋白凝固。④胨化：將凝固的酪蛋白繼續(xù)水解為胨，培養(yǎng)基上層液體變清，底部可留有未被完全胨化的酪蛋白。⑤產(chǎn)堿：乳糖未發(fā)酵，因分解含氮物 質(zhì)，生成胺及氨，培養(yǎng)基變堿，指示劑變?yōu)樗{(lán)色。 (4)應(yīng)用：主要用于梭菌、鏈球菌和丙酸桿菌的鑒定。 腦腦20100713 09:48五、抑菌試驗 1．Optochin敏感試驗 (1)原理：Optochin(奧普托欣)是鹽酸乙基氫化羥基奎寧的商品名。對肺炎鏈球菌有特異抑制作用，其作用機制可能是干擾葉酸生物合成作用，而對其它鏈球菌則無此作用。 (2)方法：用棉拭子將待檢菌的肉湯培養(yǎng)物均勻涂布于血瓊脂平板上，貼上一張含5μg奧普托欣紙片，置燭缸或二氧化碳孵箱，35℃ 孵育18~24h，觀察結(jié)果。 (3)結(jié)果：抑菌圈直徑大于14mm為敏感，小于或等于 14mm為陰性。 (4)應(yīng)用：主要用于肺炎鏈球菌（敏感）與其它鏈球菌（耐藥）的鑒別。 2．桿菌肽敏感試驗 (1)原理：A群鏈球菌對桿菌肽幾乎是100%敏感，而其它群鏈球菌對桿菌肽通常耐藥。故此試驗可對鏈球菌進(jìn)行鑒別。 (2)方法：用棉拭子將待檢菌的肉湯培養(yǎng)物均勻涂布于血瓊脂平板上，置35℃ 孵育18~24h，觀察結(jié)果。 (3) 結(jié)果：抑菌圈直徑大于10mm為敏感，小于10mm為耐藥。 (4)應(yīng)用：主要用于A群與非A群鏈球菌的鑒別。從臨床分離的菌株中有5%~15%非 A群鏈球菌也對桿菌肽敏感，如6%的B群鏈球菌、%的C群鏈球 菌和G群鏈球菌等。 3．新生霉素敏感試驗 (1)原理：金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌可被低濃度新生霉素所抑制，表現(xiàn)為敏感，而腐生葡萄球