【正文】 色的細菌，或熒光素標記的熒光抗體與相應(yīng)抗原的細菌、病毒結(jié)合形成的復(fù)合物，在熒光顯微鏡下發(fā)出熒光。 4．負染色法 背景著色而菌體本身不著色的染色為負染色法。方法：將已固定的細菌涂片滴加第一液，微加熱染5min，冷卻后水洗。滴加第一液，微加熱染1min。 （3）莢膜染色：①奧爾特莢膜染色法：將已固定的細菌涂片滴加3%沙黃染液，用火焰加溫染色，持續(xù)3min，冷卻后水洗，待干鏡檢。水洗。③挑取培養(yǎng)物少許，輕觸蒸餾水滴頂部，僅允許極少量細菌進入水滴，不可攪動，以免鞭毛脫落。④滴加第4液染30s，水洗，⑤干后置熒光顯微鏡下鏡檢觀察結(jié)果 在淡藍色背景下，抗酸桿菌呈紅色，其它細菌和細胞呈藍色。④干后顯微鏡下鏡檢觀察結(jié)果，抗酸桿菌染成紅色，非抗酸桿菌為藍色。染液因蒸發(fā)減少時，應(yīng)隨時補充，防止染液蒸干。③用95%乙醇脫色，輕輕搖動約30s，至無紫色洗落為止，水洗，甩干。 2．復(fù)染色法 用兩種或兩種以上不同染料可將細菌染成不同的顏色，除可觀察細菌的大小、形態(tài)與排列外，還反應(yīng)出細菌染色特性，具有鑒別細菌種類的價值。復(fù)染不宜太強，以免掩蓋初染的顏色。常用乙醇、丙酮等作為脫色劑。 4．媒染 凡能增強染料和被染物的親和力，使染料固定于被染物及能引起細胞膜通透性改變的物質(zhì)，稱媒染劑。 2．固定 目的是殺死細菌，凝固細菌蛋白及結(jié)構(gòu)，便于染色；促使細菌粘附在載玻片上，避免在水洗過程中被水沖掉；改變細菌對染料的通透性，有利于菌細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的染色。 三、染色標本檢查 細菌標本經(jīng)染色后，由于細菌與周圍環(huán)境間在顏色上形成鮮明對比，故在普通光學(xué)顯微鏡下可清楚地觀察到細菌的形態(tài)特征（如細菌的大小、形狀、排列等）和某些特殊結(jié)構(gòu)（如莢膜、鞭毛、芽孢等），并可根據(jù)染色反應(yīng)性對細菌加以分類鑒定。 3．毛細管法 主要用于厭養(yǎng)菌動力的檢查。梅毒蒼白密螺旋體、鉤端螺旋體、彎曲桿菌等的活菌各有特征鮮明的形態(tài)和運動方式，具有診斷意義。 5．電子顯微鏡 用電子流作為光源，波長與可見光相比差幾萬倍，大大提高了分辨力，并用磁性電圈作為光學(xué)放大系統(tǒng)，放大倍數(shù)可達數(shù)萬倍或幾十萬倍，常用于病毒顆粒和細菌超微結(jié)構(gòu)的觀察。目前大多數(shù)使用的是落射光裝置，常用高壓汞燈作為光源，可發(fā)出紫外光或藍紫光。在普通顯微鏡安裝暗視野聚光器后，光線不能從中間直接透入，視野呈暗色，當標本接受從聚光器邊緣斜射光后可發(fā)生散射，因此可在暗視野背景下觀察到光亮的微生物如細菌或螺旋體等。顯微鏡的分辨率為波長的二分之一。 一、顯微鏡檢查 由于細菌個體微小，肉眼不能看到，必須借助顯微鏡的放大才能看到。微生物學(xué)檢驗基本技術(shù)1微生物學(xué)檢驗基本技術(shù) 隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)及相關(guān)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，各學(xué)科相互交叉和滲透，醫(yī)學(xué)微生物學(xué)檢驗技術(shù)已深入到細胞、分子和基因水平，許多新技術(shù)、新方法已在臨床微生物實驗室得到廣泛應(yīng)用。一般形態(tài)和結(jié)構(gòu)可用光學(xué)顯微鏡觀察，其內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)則需用電子顯微鏡才能看清楚。故用油（浸）鏡放大1 000倍。 3．相差顯微鏡 相差顯微鏡利用相差板的光珊作用，改變直射光的光位相和振幅，將光相的差異轉(zhuǎn)換為光強度差。濾光片有激發(fā)濾光片和吸收濾光片二種。 二、不染色標本檢查 不染色標本一般可用于觀察細菌形態(tài)、動力及運動情況。常用的方法有壓滴法、懸滴法和毛細管法等。通常選用60~70mm長。 （一）細菌染色的一般程序 細菌染色的一般程序是：涂片（干燥）—固定—染色（媒染）—（脫色）—（復(fù)染）。通常用火焰加熱固定，將已干燥的涂片在火焰中迅速通過3次，以手背皮膚接觸玻片不燙為佳。常用的有明礬、鞣酸、金屬鹽和碘等，也有用加熱法促進著色。脫色劑可以查出細菌與染料結(jié)合的穩(wěn)定程度，作為鑒別染色之用。 （二）常用染色法（染液配方見第8章） 1． 單染色法 只用一種染料染色。常用的有革蘭染色法和抗酸染色法。④加稀釋石碳酸復(fù)紅或沙黃染液數(shù)滴進行復(fù)染，約30s，水洗。持續(xù)染5min（奴卡菌需要加長時間），水洗，甩干。 金胺O羅丹明B染色法：①細菌涂片固定后加第1液30~90s。 3．特殊染色法 （1）鞭毛染色（改良Ryu法）：①玻片的處理 將新載玻片浸泡在95%乙醇中。④置35℃孵箱自然干燥，不能用火焰固定，滴加鞭毛染液染1~2 min輕輕水洗。②滴加乙液，染1min。結(jié)果：菌體呈褐色，莢膜呈黃色，此法主要用于碳疽芽胞桿菌。再用第二液將涂片上的染液洗去，勿再水洗，傾去硫酸銅液，以吸水紙吸干鏡檢。用第二液脫色2min，水洗。最常見的是墨汁負染色法，用來觀察真菌及細菌莢膜等。 第二節(jié) 微生物培養(yǎng)與分離方法 大多數(shù)細菌均可以通過人工方法培養(yǎng)，而衣原體和病毒的分離培養(yǎng)往往需要活組織、雞胚、特殊細胞株及動物接種。臨床送檢的標本如痰、咽試子、泌尿生殖道的分泌物和糞便等細菌檢驗均需要借助瓊脂平板劃線分離目的菌。一個成功分區(qū)劃線的平板，培養(yǎng)后分別觀察1區(qū)形成菌苔，2區(qū)菌落連成線，3區(qū)和4區(qū)可分離到單個菌落。用接種環(huán)（針）挑取單個菌落或培養(yǎng)物，從培養(yǎng)基斜面底部向上劃一條直線，然后再從底部沿直線向上曲折連續(xù)劃線，直至斜面近頂端處止。雙糖鐵等有高層及斜面之分的培養(yǎng)基，穿刺高層部分，退出接種針后直接劃線接種斜面部分。 5．傾注平板法 本法主要用于飲水、飲料、牛乳和尿液等標本中的細菌計數(shù)。將一定量或適量的菌液加到瓊脂培養(yǎng)基表面，然后用滅菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反復(fù)涂布，使被接種液均勻分布于瓊脂表面，然后貼上藥敏紙片，或直接培養(yǎng)，本法經(jīng)培養(yǎng)后細菌形成菌苔。少數(shù)生長緩慢的細菌需要培養(yǎng)37d甚至1個月才能生長。常用的培養(yǎng)法如下。將缸置于35℃普通孵育箱內(nèi)孵育。分別置容器內(nèi)，連同容器置于玻璃缸內(nèi)，蓋緊密封，傾斜缸位使鹽酸與碳酸氫鈉接觸而生成二氧化碳。厭氧培養(yǎng)常用的方法有：物理法、化學(xué)法、生物法。據(jù)細菌菌落表面特征不同，可將菌落分為3型： ①光滑型菌落（S型菌落）：菌落表面光滑、濕潤、邊緣整齊，新分離的細菌大多呈光滑型菌落。但也有少數(shù)細菌新分離的毒力株就是R型，如炭疽孢桿菌、結(jié)核分枝菌等。①α溶血：又稱草綠色溶血，菌落周圍培養(yǎng)基出現(xiàn)1~2mm的草綠色環(huán)，為高鐵血紅蛋白所致；②β溶血：又稱完全溶血，菌落周圍形成一個完全清晰透明的溶血環(huán)，是細菌產(chǎn)生的溶血素使紅細胞完全溶解所致；③γ溶血：即不溶血，菌落周圍的培養(yǎng)基沒有變化，紅細胞沒有溶解或缺損。 3．半固體培養(yǎng)基 半固體培養(yǎng)基主要用于細菌動力試驗，有鞭毛的細菌除了沿穿刺線生長外，在穿刺線兩側(cè)也可見羽毛狀或云霧狀混濁生長。利用生物化學(xué)方法來鑒別不同細菌，稱為細菌的生物化學(xué)試驗或稱生化反應(yīng)。 (2)方法：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中（）~％（w/v）的特定糖（醇、苷）類。 (3)結(jié)果：能分解糖（醇、苷）產(chǎn)酸的細菌，培養(yǎng)基中的指示劑呈酸性反應(yīng)（如酚紅變?yōu)辄S色），產(chǎn)氣的細菌可在小倒管（Durham小管）中產(chǎn)生氣泡，固體培養(yǎng)基則產(chǎn)生裂隙。 表641 常用于細菌糖發(fā)酵試驗的糖、醇類 單糖 四碳糖：赤蘚糖 , 五碳糖：核糖 核酮糖 木糖 阿拉伯糖, 六碳糖：葡萄糖 果糖 半乳糖 甘露糖 雙糖 蔗糖（葡萄糖＋果糖） 乳糖（葡萄糖＋半乳糖） 麥芽糖（兩分子葡萄糖） 三糖 棉子糖（葡萄糖＋果糖＋半乳糖） 多糖 菊糖（多分子果糖） 淀粉 醇類 側(cè)金盞花醇 衛(wèi)茅醇 甘露醇 山梨醇 非糖類 肌醇 2．葡萄糖代謝類型鑒別試驗 (1)原理：細菌在分解葡萄糖的過程中，必須有分子氧參加的，稱為氧化型；能進行無氧降解的為發(fā)酵型；不分解葡萄糖的細菌為產(chǎn)堿型。置35℃孵箱孵育48h以上。也可用于鑒別葡萄球菌（發(fā)酵型）與微球菌（氧化型）。 (3)結(jié)果判定：呈現(xiàn)紅色者為陽性，桔黃色為陰性，桔紅色為弱陽性。有些細菌只有半乳糖苷酶，因而只能遲緩發(fā)酵乳糖，所有乳糖快速發(fā)酵和遲緩發(fā)酵的細菌均可快速水解鄰硝基酚βD半乳糖苷（OnitrophenylβDgalactopyranoside,ONPG）而生成黃色的鄰硝基酚。 (4)應(yīng)用：可用于遲緩發(fā)酵乳糖細菌的快速鑒定，本法對于迅速及遲緩分解乳糖的細菌均可短時間內(nèi)呈現(xiàn)陽性。在堿性條件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰，進而與培養(yǎng)基中的精氨酸等含胍基的物質(zhì)結(jié)合形成紅色化合物。 (4)應(yīng)用：主要用于大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌的鑒別。七葉苷被細菌分解生成的七葉素，七葉素與培養(yǎng)基中的枸櫞酸鐵的二價鐵離子發(fā)生反應(yīng)形成黑色化合物。D群鏈球菌本試驗為陽性。 (4)應(yīng)用：用于白喉棒狀桿菌生物型的分型，重型淀粉水解試驗陽性，輕、中型陰性；芽胞桿菌屬菌種和厭氧菌某些種的鑒定。 (3)結(jié)果：紫紅色為陽性，與對照管顏色相同為陰性。α酮基葡萄糖酸是一種還原性物質(zhì)，可與班氏試劑起反應(yīng)，出現(xiàn)棕色或磚紅色的氧化亞銅沉淀。 　　(4)應(yīng)用：主要用于假單胞菌的鑒定和腸桿菌科菌分群。醋酸鉛是最敏感的方法。 2．明膠液化試驗 (1)原理：細菌分泌的胞外蛋白水解酶（明膠酶）能分解明膠，使明膠失去凝固能力而液化。 (4)應(yīng)用：奇異變形桿菌、普通變形桿菌、沙雷菌屬和陰溝腸桿菌等到能液化明膠，腸桿菌科中的其它細菌很少液化明膠。 (2)方法：將待檢菌接種于富含色氨酸的蛋白胨水培養(yǎng)基中，35℃孵育24~48h，加入靛基質(zhì)試劑，觀察結(jié)果。細菌產(chǎn)生的苯丙氨酸脫氨酶使苯丙氨酸脫氨后生成苯丙酮酸，加入三氯化鐵試劑后產(chǎn)生綠色反應(yīng)。 (4)應(yīng)用：變形桿菌屬、普羅威登菌屬、摩根菌屬均為陽性，腸桿菌科其它細菌均為陰性。 (3)結(jié)果：若為溴甲酚紫指示劑，則試驗管紫色為陽性，黃色為陰性，對照管應(yīng)為黃色。氨及腐胺均為堿性物質(zhì)，故可使培養(yǎng)基變堿，用 指示劑指示出來。 (4) 應(yīng)用：主要用于腸桿菌科及假單胞菌屬的鑒定。 (4)應(yīng)用：主要用于腸桿菌科變形桿菌屬、普羅威登菌屬、克雷伯菌屬及假單胞菌屬的鑒定。 (4)應(yīng)用：霍亂弧菌呈陽性反應(yīng)，但本試驗并非霍亂弧菌所特有。 (3)結(jié)果：若用溴麝香草酚蘭指示劑，斜面出現(xiàn)菌落或菌苔，培養(yǎng)基變藍色為陽性；無菌落生長，培養(yǎng)基綠色為陰性。 2．丙二酸鹽利用試驗 (1)原理：某些細菌能利用丙二酸鹽作為唯一碳源，丙二酸鹽被分解生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿。 (4)應(yīng)用：腸桿菌科中亞利桑那菌和克雷伯菌屬為陽性，枸櫞酸桿菌屬、腸桿菌屬和哈夫尼亞菌屬有不同生物型反應(yīng)，其它各菌屬均為陰性。 (4) 應(yīng)用：主要用于大腸埃希菌和志賀菌屬的鑒別，前者為陽性，而后者為陰性。 (4) 應(yīng)用：主要用于B群鏈球菌的鑒定。如不生長，或稍有生長，但培養(yǎng)基顏色不變?yōu)殛幮?。此酶并不直接與氧化酶試劑起反應(yīng)，而是先使細胞色素C氧化，然后 此氧化型細胞色素C再使對苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。 (3)結(jié)果：陽性者立即變粉紅色，5~10s內(nèi)呈深紫色。莫拉菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬等均為陽性。 (2)方法：取潔凈玻片1張，用接種環(huán)挑取細菌，加3％H2O2 1滴，立即觀察結(jié)果。此外，金氏桿菌屬的細菌也為陰性。 3．凝固酶試驗 (1)原理：凝固酶試驗是鑒定葡萄球菌致病性的重要試驗。②試管法：于試管內(nèi)加1﹕，再加1~2個待試菌菌落，置37℃水浴，每30min觀察1次結(jié)果。 (4)應(yīng)用：本試驗僅用于致病性葡萄球的鑒定。④本試驗也可用市購的膠乳凝集試驗試劑盒測定。 (2)方法：在DNA瓊脂平板上點種待檢菌，35℃孵育18~24h，用1 mol/L鹽酸傾注平板，觀察結(jié)果。 5．膽汁溶菌試驗 (1)原理：膽汁或去氧膽酸鈉能導(dǎo)致某些細菌溶解，一方面是由于膽汁或去氧膽酸鈉降低了細菌細胞膜上的表面張力，使細菌的細胞膜破損或使菌體裂 解。35℃孵育每小時觀察1次結(jié)果。 (4)應(yīng)用：用于肺炎鏈球菌的鑒定。硝酸鹽或亞硝酸鹽如果還原生成氣體的終末產(chǎn)物如氮或氧化氮，則稱為脫硝化或脫氮化作用。 (3)結(jié)果：出現(xiàn)紅色為陽性反應(yīng)。腸桿菌科細菌均能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽；假單胞菌屬中有的細菌能產(chǎn)生氮氣，如銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、斯氏假單胞菌，有的則能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，如鼻疽假單胞菌等；厭氧菌如韋榮菌也能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽。 (4) 應(yīng)用：該試驗主要用于厭氧的鑒定。 (2)方法：取待檢菌接種于磷酸酚酞瓊脂平板上，置35℃孵育18~24h，于平皿蓋內(nèi)加1滴濃氨水，熏蒸片刻，觀察結(jié)果。 9．脂酶試驗 (1)原理：細菌產(chǎn)生的脂酶可分解脂肪為游離脂肪酸。 (4)應(yīng)用：主要用于厭氧菌鑒定。 (2)方法：在羊血或馬血瓊脂平板上，先以β溶血的金黃色葡萄球菌劃一橫線接種。 (4)應(yīng)用：主要用于B群鏈球菌（陽性）的鑒定，其他鏈球菌均為陰性。 (3)結(jié)果：①產(chǎn)酸：發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，使指示劑變?yōu)榉奂t色。⑤產(chǎn)堿：乳糖未發(fā)酵，因分解含氮物 質(zhì)，生成胺及氨，培養(yǎng)基變堿，指示劑變?yōu)樗{色。 (2)方法：用棉拭子將待檢菌的肉湯培養(yǎng)物均勻涂布于血瓊脂平板上，貼上一張含5μg奧普托欣紙片，置燭缸或二氧化碳孵箱，35℃ 孵育18~24h，觀察結(jié)果。故此試驗可對鏈球菌進行鑒別。從臨床分離的菌株中有5%~15%非 A群鏈球菌也對桿菌肽敏感，如6%的B群鏈球菌、%的C群鏈球 菌和G群鏈球菌等。 (4)應(yīng)用：主要用于葡萄球菌某些種的鑒定。 (4)應(yīng)用：主要用于弧菌屬、鄰單胞菌屬與氣單胞菌屬的鑒別，弧菌屬和鄰單胞菌屬菌為敏感，氣單胞菌屬菌為耐藥。 (2)方法：將待檢菌接種于氰化鉀培養(yǎng)基中，同時接種一支不含氰化鉀的對照培養(yǎng)基，置35℃孵育24~48h，觀察結(jié)果。細菌分解葡萄糖、乳糖或蔗糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，使斜面與底層均呈黃色，且有氣泡。如銅綠假單胞菌。 ④斜面酸性/底層酸性：葡萄糖和乳糖（和TSI中的蔗糖）發(fā)酵，是發(fā)酵乳糖的大腸菌群的特征，如大腸埃希菌、克雷伯菌屬和腸桿菌屬。 2．氫氧化鉀拉絲試驗 (1)原理：革蘭陰性細菌的細胞壁在稀堿溶液中易于破裂，釋放出未斷裂的DNA螺旋，使氫氧化鉀菌懸液呈現(xiàn)粘性，可用接種環(huán)攪拌后拉出粘絲來，而革蘭陽性細菌在稀堿溶液中沒有上述變化。大多數(shù)革蘭陰性菌于5~10s內(nèi)出現(xiàn)陽性反應(yīng)，有的則需30~45s，假單胞菌、無色桿菌、黃桿菌、產(chǎn)堿桿菌、莫拉菌等大多數(shù)在10s內(nèi)呈陽性，不動桿菌、莫拉菌反應(yīng)較慢，大多數(shù)菌株在60s內(nèi)出現(xiàn)陽性，而革蘭陽性菌在60s以后仍為陰性。血清學(xué)鑒定即用含已知特異性抗體的免疫血清(診斷血清)去檢測患