【正文】 微生物學(xué)檢驗(yàn)基本技術(shù)1微生物學(xué)檢驗(yàn)基本技術(shù) 隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)及相關(guān)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，各學(xué)科相互交叉和滲透，醫(yī)學(xué)微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)已深入到細(xì)胞、分子和基因水平，許多新技術(shù)、新方法已在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室得到廣泛應(yīng)用。醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的基本任務(wù)之一是利用微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)，準(zhǔn)確、快速檢驗(yàn)和鑒定臨床標(biāo)本中的微生物，并對引起感染的微生物進(jìn)行耐藥性監(jiān)測，為臨床對感染性疾病診斷、治療、流行病學(xué)調(diào)查及研究等提供科學(xué)依據(jù)。 第一節(jié)　微生物形態(tài)學(xué)檢查細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查是細(xì)菌檢驗(yàn)的重要方法之一，它是細(xì)菌分類和鑒定的基礎(chǔ)，可根據(jù)其形態(tài)、結(jié)構(gòu)和染色反應(yīng)性等，為進(jìn)一步鑒定提供參考依據(jù)。 一、顯微鏡檢查 由于細(xì)菌個體微小，肉眼不能看到，必須借助顯微鏡的放大才能看到。一般形態(tài)和結(jié)構(gòu)可用光學(xué)顯微鏡觀察，其內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)則需用電子顯微鏡才能看清楚。常用顯微鏡有如下幾種。 1．普通光學(xué)顯微鏡 　　采用自然光或燈光為光源。顯微鏡的分辨率為波長的二分之一。故用油（浸）鏡放大1 000倍。普通光學(xué)顯微鏡可用于細(xì)菌、放線菌和真菌等的觀察。 2．暗視野顯微鏡 常用于觀察不染色微生物形態(tài)和運(yùn)動。在普通顯微鏡安裝暗視野聚光器后，光線不能從中間直接透入，視野呈暗色，當(dāng)標(biāo)本接受從聚光器邊緣斜射光后可發(fā)生散射，因此可在暗視野背景下觀察到光亮的微生物如細(xì)菌或螺旋體等。 3．相差顯微鏡 相差顯微鏡利用相差板的光珊作用，改變直射光的光位相和振幅，將光相的差異轉(zhuǎn)換為光強(qiáng)度差。在相差顯微鏡下，當(dāng)光線透過不染色標(biāo)本時，由于標(biāo)本不同部位的密度不一致而引起光相的差異，可觀察到微生物形態(tài)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)和運(yùn)動方式等。 4．熒光顯微鏡 熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡基本相同，主要區(qū)別在于光源、濾光片和聚光器。目前大多數(shù)使用的是落射光裝置，常用高壓汞燈作為光源，可發(fā)出紫外光或藍(lán)紫光。濾光片有激發(fā)濾光片和吸收濾光片二種。用藍(lán)光的熒光顯微鏡除可用一般明視野聚光器外，也可用暗視野聚光器，以加強(qiáng)熒光與背景的對比。本法適用于對熒光色素染色或與熒光抗體結(jié)合的細(xì)菌的檢測或鑒定。 5．電子顯微鏡 用電子流作為光源，波長與可見光相比差幾萬倍，大大提高了分辨力，并用磁性電圈作為光學(xué)放大系統(tǒng)，放大倍數(shù)可達(dá)數(shù)萬倍或幾十萬倍，常用于病毒顆粒和細(xì)菌超微結(jié)構(gòu)的觀察。 二、不染色標(biāo)本檢查 不染色標(biāo)本一般可用于觀察細(xì)菌形態(tài)、動力及運(yùn)動情況。細(xì)菌未染色時無色透明，在顯微鏡下主要靠細(xì)菌的折光率與周圍環(huán)境的不同來進(jìn)行觀察。有鞭毛的細(xì)菌運(yùn)動活潑，無鞭毛的細(xì)菌則呈不規(guī)則布朗運(yùn)動。梅毒蒼白密螺旋體、鉤端螺旋體、彎曲桿菌等的活菌各有特征鮮明的形態(tài)和運(yùn)動方式，具有診斷意義。常用的方法有壓滴法、懸滴法和毛細(xì)管法等。 1．懸滴法 在潔凈凹玻片的凹孔四周涂上凡士林，用接種環(huán)取一環(huán)菌懸液放在蓋玻片中央，再將凹玻片的凹孔對準(zhǔn)蓋玻片中央的液滴并蓋上，然后迅速翻轉(zhuǎn)，輕壓蓋玻片，使其與凹孔邊緣的凡士林粘緊封閉后置高倍鏡下（或暗視野）觀察。 2．壓滴法 用接種環(huán)取一環(huán)菌懸液置于潔凈玻片的中央，在菌懸液上輕輕蓋上一蓋玻片，注意避免產(chǎn)生氣泡并防止菌懸液外溢，靜止數(shù)秒鐘后置高倍鏡下明視野（或暗視野）觀察。 3．毛細(xì)管法 主要用于厭養(yǎng)菌動力的檢查。通常選用60~70mm長。~，用火焰將毛細(xì)管兩端熔封。并用塑膠紙將毛細(xì)管固定在載玻片上，置高倍鏡下暗視野觀察。 三、染色標(biāo)本檢查 細(xì)菌標(biāo)本經(jīng)染色后，由于細(xì)菌與周圍環(huán)境間在顏色上形成鮮明對比，故在普通光學(xué)顯微鏡下可清楚地觀察到細(xì)菌的形態(tài)特征（如細(xì)菌的大小、形狀、排列等）和某些特殊結(jié)構(gòu)（如莢膜、鞭毛、芽孢等），并可根據(jù)染色反應(yīng)性對細(xì)菌加以分類鑒定。 （一）細(xì)菌染色的一般程序 細(xì)菌染色的一般程序是：涂片（干燥）—固定—染色（媒染）—（脫色）—（復(fù)染）。 1．涂片制備 血液、分泌物、排泄物、穿刺液和液體培養(yǎng)物，直接在載玻片上作薄膜涂片；尸檢或感染動物組織，病變局部涂抹采樣的棉拭子直接涂片。固體培養(yǎng)基上的菌落或菌苔的制片，先用接種環(huán)取一環(huán)生理鹽水置載玻片中央，再用無菌接種環(huán)取少量的培養(yǎng)物在生理鹽水中磨勻，涂布成1cm2大小的涂面，置室溫下自然干燥或遠(yuǎn)火慢慢烘干。 2．固定 目的是殺死細(xì)菌，凝固細(xì)菌蛋白及結(jié)構(gòu)，便于染色；促使細(xì)菌粘附在載玻片上，避免在水洗過程中被水沖掉；改變細(xì)菌對染料的通透性，有利于菌細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的染色。通常用火焰加熱固定，將已干燥的涂片在火焰中迅速通過3次，以手背皮膚接觸玻片不燙為佳。 3．染色 根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康牟煌?，選擇不同的染色方法進(jìn)行染色。染色時滴加染液，以復(fù)蓋標(biāo)本為度。 4．媒染 凡能增強(qiáng)染料和被染物的親和力，使染料固定于被染物及能引起細(xì)胞膜通透性改變的物質(zhì)，稱媒染劑。常用的有明礬、鞣酸、金屬鹽和碘等，也有用加熱法促進(jìn)著色。媒染劑可用于初染與復(fù)染之間，也可用于固定之后或含于固定液、染色中。 5．脫色 凡能使已著色的被染物脫去顏色的化學(xué)試劑稱為脫色劑。常用乙醇、丙酮等作為脫色劑。脫色劑可以查出細(xì)菌與染料結(jié)合的穩(wěn)定程度，作為鑒別染色之用。 6．復(fù)染 已脫色處理的細(xì)菌或其結(jié)構(gòu)常以復(fù)染液作復(fù)染以便于觀察。復(fù)染液與初染液的顏色不同而成一鮮明對比。復(fù)染不宜太強(qiáng)，以免掩蓋初染的顏色。 （二）常用染色法（染液配方見第8章） 1． 單染色法 只用一種染料染色。由于大多數(shù)細(xì)菌胞漿內(nèi)含有酸性物質(zhì)，可與堿性染料結(jié)合，故常用呂氏美藍(lán)、結(jié)晶紫和稀釋石碳酸復(fù)紅等染液。此法可觀察細(xì)菌的大小、形態(tài)與排列，不能顯示細(xì)菌的結(jié)構(gòu)與染色特性。 2．復(fù)染色法 用兩種或兩種以上不同染料可將細(xì)菌染成不同的顏色，除可觀察細(xì)菌的大小、形態(tài)與排列外，還反應(yīng)出細(xì)菌染色特性，具有鑒別細(xì)菌種類的價值。常用的有革蘭染色法和抗酸染色法。 （1）革蘭染色：①細(xì)菌涂片經(jīng)火焰固定，加結(jié)晶紫染液染1min，清水沖去染液。②加碘液媒染 1min，水洗，甩干。③用95%乙醇脫色，輕輕搖動約30s，至無紫色洗落為止，水洗，甩干。④加稀釋石碳酸復(fù)紅或沙黃染液數(shù)滴進(jìn)行復(fù)染，約30s，水洗。⑤干后顯微鏡下鏡檢觀察結(jié)果，革蘭陽性菌染成紫色，革蘭陰性菌為紅色。 （2）抗酸染色：萋尼 (ZiehlNeelse)抗酸染色法：①細(xì)菌涂片經(jīng)火焰固定，加石炭酸復(fù)紅溶液，徐徐加熱至有蒸氣出現(xiàn)，切不可沸騰。染液因蒸發(fā)減少時，應(yīng)隨時補(bǔ)充，防止染液蒸干。持續(xù)染5min（奴卡菌需要加長時間），水洗，甩干。②滴加3%鹽酸乙醇脫色，不時搖動玻片至無紅色脫落為止，水洗，甩干。③加呂氏美藍(lán)復(fù)染液數(shù)滴復(fù)染1min，水洗。④干后顯微鏡下鏡檢觀察結(jié)果，抗酸桿菌染成紅色，非抗酸桿菌為藍(lán)色。 金胺O羅丹明B染色法：①細(xì)菌涂片固定后加第1液30~90s。②棄去第1液后加第2液染15min。③用第3液脫色1~2min，水洗。④滴加第4液染30s，水洗，⑤干后置熒光顯微鏡下鏡檢觀察結(jié)果 在淡藍(lán)色背景下，抗酸桿菌呈紅色，其它細(xì)菌和細(xì)胞呈藍(lán)色。 3．特殊染色法 （1）鞭毛染色（改良Ryu法）：①玻片的處理 將新載玻片浸泡在95%乙醇中。臨用時取出，以干凈紗布擦干。②在玻片上滴蒸餾水1滴。③挑取培養(yǎng)物少許，輕觸蒸餾水滴頂部，僅允許極少量細(xì)菌進(jìn)入水滴，不可攪動，以免鞭毛脫落。④置35℃孵箱自然干燥，不能用火焰固定，滴加鞭毛染液染1~2 min輕輕水洗。⑤干后顯微鏡鏡檢觀察結(jié)果 鞭毛和菌體呈紫色。 （2）異染顆粒染色(阿爾培托法)：①細(xì)菌涂片經(jīng)火焰固定，加甲液染色3~5min。水洗。②滴加乙液，染1min。水洗。③干后顯微鏡鏡檢觀察結(jié)果 菌體呈綠色，異染顆粒呈藍(lán)黑色,用于白喉棒狀桿菌染色。 （3）莢膜染色：①奧爾特莢膜染色法：將已固定的細(xì)菌涂片滴加3%沙黃染液，用火焰加溫染色，持續(xù)3min，冷卻后水洗，待干鏡檢。結(jié)果：菌體呈褐色，莢膜呈黃色，此法主要用于碳疽芽胞桿菌。②Hiss氏硫酸銅法：染液：第一液為結(jié)晶紫乙醇飽和液5ml加蒸餾水95ml 的混合液；第二液為20%硫酸銅水溶液。方法：細(xì)菌涂片自然干燥，乙醇固定。滴加第一液，微加熱染1min。再用第二液將涂片上的染液洗去，勿再水洗，傾去硫酸銅液，以吸水紙吸干鏡檢。結(jié)果：菌體及背景呈紫色，莢膜呈鮮藍(lán)色或不著色。 （4）芽胞染色：染液：第一液為萋－納氏石炭酸復(fù)紅液，第二液為95%乙醇，第三液為堿性美藍(lán)液。方法：將已固定的細(xì)菌涂片滴加第一液，微加熱染5min，冷卻后水洗。用第二液脫色2min，水洗。加第三液復(fù)染1min，水洗，待干鏡檢。結(jié)果：菌體呈藍(lán)色，芽胞呈紅色。 4．負(fù)染色法 背景著色而菌體本身不著色的染色為負(fù)染色法。最常見的是墨汁負(fù)染色法，用來觀察真菌及細(xì)菌莢膜等。在標(biāo)本涂片處滴加染液，混合后加上蓋玻片(勿產(chǎn)生氣泡)，輕壓。在低倍鏡下尋找有莢膜的菌細(xì)胞，轉(zhuǎn)高倍鏡或油鏡確認(rèn)，如新型隱球菌可見寬厚透亮的莢膜，背景為黑色。 5．熒光染色法 經(jīng)熒光素染色的細(xì)菌，或熒光素標(biāo)記的熒光抗體與相應(yīng)抗原的細(xì)菌、病毒結(jié)合形成的復(fù)合物，在熒光顯微鏡下發(fā)出熒光。 第二節(jié) 微生物培養(yǎng)與分離方法 大多數(shù)細(xì)菌均可以通過人工方法培養(yǎng)，而衣原體和病毒的分離培養(yǎng)往往需要活組織、雞胚、特殊細(xì)胞株及動物接種。只有將微生物培養(yǎng)出來才能對它進(jìn)行研究、鑒定和應(yīng)用。 一、接種與分離方法 根據(jù)待檢標(biāo)本的性質(zhì)、培養(yǎng)目的和所用培養(yǎng)基的種類，采用不同的接種方法。 1．平板劃線分離培養(yǎng)法 對混有多種細(xì)菌的臨床標(biāo)本，采用劃線分離和培養(yǎng)，使原來混雜在一起的細(xì)菌沿劃線在瓊脂平板表面分離，得到分散的單個菌落，以獲得純種。臨床送檢的標(biāo)本如痰、咽試子、泌尿生殖道的分泌物和糞便等細(xì)菌檢驗(yàn)均需要借助瓊脂平板劃線分離目的菌。平板劃線分離法通常有兩種方法： （1）分區(qū)劃線分離法：此法常用于含菌量較多的標(biāo)本如痰、泌尿生殖道的分泌物和糞便或混合細(xì)菌的分離。先用接種環(huán)挑取標(biāo)本涂布于瓊脂平板1區(qū)（占培養(yǎng)基總面積的1/4）并作數(shù)條劃線，再于4區(qū)依次劃線。每劃完一個區(qū)域，均將接種環(huán)燒灼滅菌1次，冷后再劃下一區(qū)域，每一區(qū)域的劃線均與上一區(qū)域的劃線交接1~3次。一個成功分區(qū)劃線的平板，培養(yǎng)后分別觀察1區(qū)形成菌苔，2區(qū)菌落連成線，3區(qū)和4區(qū)可分離到單個菌落。 （2）連續(xù)劃線分離法：此法常用于含菌量不多的標(biāo)本或培養(yǎng)物中的細(xì)菌分離培養(yǎng)。方法是先將接種物在瓊脂平板上1/5處輕輕涂抹，然后再用接種環(huán)或拭子在平板表面曲線連續(xù)劃線接種，直至劃滿瓊脂平板表面。 2． 瓊脂斜面接種法 主要用于菌落的移種，以獲得純種進(jìn)行鑒定和保存菌種等。用接種環(huán)（針）挑取單個菌落或培養(yǎng)物，從培養(yǎng)基斜面底部向上劃一條直線，然后再從底部沿直線向上曲折連續(xù)劃線，直至斜面近頂端處止。生化鑒定培養(yǎng)基斜面接種，用接種針挑取待鑒定細(xì)菌的菌落，從斜面中央垂直刺入底部，抽出后在斜面上由下至上曲折劃線接種。 3．穿刺接種法 此法多用于半固體培養(yǎng)基或雙糖鐵、明膠等具有高層的培養(yǎng)基接種，半固體培養(yǎng)基的穿刺接種可用于觀察細(xì)菌的動力。接種時用接種針挑取菌落，再沿穿刺線退出接種針。雙糖鐵等有高層及斜面之分的培養(yǎng)基，穿刺高層部分，退出接種針后直接劃線接種斜面部分。 4．液體培養(yǎng)基接種法 用于各種液體培養(yǎng)基如肉湯、蛋白胨水、糖發(fā)酵管等的接種。用接種環(huán)挑取單個菌落，傾斜液體培養(yǎng)管，在液面與管壁交界處研磨接種物（以試管直立后液體淹沒接種物為準(zhǔn)）。此接種法應(yīng)避免接種環(huán)與液體過多接觸，更不應(yīng)在液體中混勻、攪拌，以免形成氣溶膠，造成實(shí)驗(yàn)室污染。 5．傾注平板法 本法主要用于飲水、飲料、牛乳和尿液等標(biāo)本中的細(xì)菌計(jì)數(shù)。取純培養(yǎng)物的稀釋或原標(biāo)本1ml至無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，再將已融化并冷卻至45~50℃左右的瓊脂培養(yǎng)基15~20ml傾注入該無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，混勻，待凝固后置37℃培養(yǎng)，長出菌落后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，以求出每毫升標(biāo)本中所含菌數(shù)。先數(shù)6個方格（每格為1cm2）中菌落數(shù)，求出每格的平均菌落數(shù)，并算出平皿直徑，然后按下列公式計(jì)數(shù)，求出每毫升標(biāo)本中的細(xì)菌數(shù)。 全平板菌落數(shù)=每方格的平均菌落數(shù)лr2 每ml標(biāo)本中的細(xì)菌數(shù)=全平板菌落數(shù)稀釋倍數(shù) 6．涂布接種法 本法多用于紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)的細(xì)菌接種。將一定量或適量的菌液加到瓊脂培養(yǎng)基表面，然后用滅菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反復(fù)涂布，使被接種液均勻分布于瓊脂表面，然后貼上藥敏紙片，或直接培養(yǎng)，本法經(jīng)培養(yǎng)后細(xì)菌形成菌苔。 二、細(xì)菌的培養(yǎng)方法 根據(jù)不同的標(biāo)本及不同的培養(yǎng)目的，可選用不同的培養(yǎng)方法。通常把細(xì)菌的培養(yǎng)方法分為需氧培養(yǎng)、二氧化碳培養(yǎng)、微需氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)四種。 1．需氧培養(yǎng) 是指需氧菌或兼性厭氧菌在有氧條件下的培養(yǎng)，將已接種好的平板、斜面、液體培養(yǎng)基等在空氣中置35℃孵育箱內(nèi)孵育18~24h，無特殊要求的細(xì)菌均可生長。少數(shù)生長緩慢的細(xì)菌需要培養(yǎng)37d甚至1個月才能生長。為使孵育箱內(nèi)保持一定的濕度，可在其內(nèi)放置一杯水。對培養(yǎng)時間較長的培養(yǎng)基，接種后應(yīng)將試管口塞好棉塞或硅膠塞后用石蠟凡士林封固，以防培養(yǎng)基干裂。 2．二氧化碳培養(yǎng) 某些細(xì)菌，如肺炎鏈球菌、淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、布魯氏菌和流感嗜血桿菌等的培養(yǎng)，特別是在初次分離時，須在5%~10 %二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)才能生長。常用的培養(yǎng)法如下。 （1）二氧化碳培養(yǎng)箱法：二氧化碳孵箱能自動調(diào)節(jié)二氧化碳的含量、溫度和濕度，培養(yǎng)物置于孵育箱內(nèi)閣，孵育一定時間后可直接觀察生長結(jié)果。 （2）燭缸培養(yǎng)法：取有蓋磨口標(biāo)本缸或玻璃干燥器，將接種好的培養(yǎng)基放入缸內(nèi)，點(diǎn)燃蠟燭后放在缸內(nèi)稍高于培養(yǎng)物的位置上，缸蓋或缸口均涂以凡士林，加蓋密閉。因缸內(nèi)蠟燭燃燒氧逐漸減少，數(shù)分鐘后蠟燭自行熄滅，此時容器內(nèi)二氧化碳含量約占5%~10%。將缸置于35℃普通孵育箱內(nèi)孵育。 （3）氣袋法：選用無毒透明的塑料袋，將已接種標(biāo)本的培養(yǎng)皿放入袋內(nèi)，盡量祛除袋內(nèi)空氣后將開口處折疊并用彈簧夾夾緊袋口。使袋呈密閉狀態(tài)，執(zhí)斷袋內(nèi)已置的二氧化碳產(chǎn)氣管（安瓿）產(chǎn)生二氧化碳，數(shù)分鐘內(nèi)就可達(dá)到需要的二氧化碳培養(yǎng)環(huán)境，置于35℃孵育箱內(nèi)孵育。 （4）化學(xué)法：常用碳酸氫鈉鹽酸法。，分別置容器內(nèi)，連同容器置于玻璃缸內(nèi)，蓋緊密封，傾斜缸位使鹽酸與碳酸氫鈉接觸而生成二氧化碳。于35℃孵育箱內(nèi)孵育。 3．微需氧培養(yǎng) 微需氧菌培養(yǎng)在大氣中及