【正文】 絕對(duì)無(wú)氧環(huán)境中均不能生長(zhǎng)，在含有5%6% 氧氣，5%10%二氧化碳和85%氮?dú)獾臍怏w環(huán)境中才可生長(zhǎng)，將標(biāo)本接種到培養(yǎng)基上，置于上述氣體環(huán)境中，35℃進(jìn)行培養(yǎng)即微需氧培養(yǎng)法。 4．厭氧培養(yǎng) 厭氧菌對(duì)氧敏感，培養(yǎng)過(guò)程中需造成低氧化還原電勢(shì)的厭氧環(huán)境。厭氧培養(yǎng)常用的方法有：物理法、化學(xué)法、生物法。如厭氧罐培養(yǎng)法、氣袋法、厭氧手套箱法、需氧菌共生厭氧法等。 三、細(xì)菌在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)特性 1．固體培養(yǎng)基 標(biāo)本或液體培養(yǎng)物劃線接種到固體培養(yǎng)基表面后，單個(gè)細(xì)菌經(jīng)分裂繁殖可形成一個(gè)肉眼可見(jiàn)的細(xì)菌集團(tuán)，稱為菌落（colony）。 (1)菌落的形態(tài)特征：大小、形狀（露滴狀、圓形、菜花樣、不規(guī)則等）、突起或扁平、凹陷、邊緣（光滑、波形、鋸齒狀、卷發(fā)狀等）、顏色（紅色、灰白色、黑色、綠色、無(wú)色、黃色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度（不透明、半透明、透明等）和粘度等。據(jù)細(xì)菌菌落表面特征不同，可將菌落分為3型： ①光滑型菌落（S型菌落）：菌落表面光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊，新分離的細(xì)菌大多呈光滑型菌落。②粗糙型菌落（R型菌落）：菌落表面粗糙、干燥、呈皺紋或顆粒狀，邊緣大多不整齊。R型菌落多為S型細(xì)菌變異失去菌體表面多糖或蛋白質(zhì)形成。R型細(xì)菌抗原不完整，毒力和抗吞噬能力都比S型細(xì)菌弱。但也有少數(shù)細(xì)菌新分離的毒力株就是R型，如炭疽孢桿菌、結(jié)核分枝菌等。③粘液型菌落（M型菌落）：菌落粘稠、有光澤、似水珠樣。多見(jiàn)于厚莢膜或豐富粘液層的細(xì)菌、結(jié)核桿菌等。 (2)菌落溶血特征：菌落溶血有下列3種情況。①α溶血：又稱草綠色溶血，菌落周圍培養(yǎng)基出現(xiàn)1~2mm的草綠色環(huán)，為高鐵血紅蛋白所致；②β溶血：又稱完全溶血，菌落周圍形成一個(gè)完全清晰透明的溶血環(huán)，是細(xì)菌產(chǎn)生的溶血素使紅細(xì)胞完全溶解所致；③γ溶血：即不溶血，菌落周圍的培養(yǎng)基沒(méi)有變化，紅細(xì)胞沒(méi)有溶解或缺損。 (3)色素：有些細(xì)菌產(chǎn)生水溶性色素，使菌落和周圍的培養(yǎng)基出現(xiàn)綠色、金黃色、白色、橙色、檸檬色等顏色，產(chǎn)生的色素有水溶性或脂溶性。 (4)氣味：某些細(xì)菌在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖后可產(chǎn)生特殊氣味，如銅綠假單胞菌（生姜?dú)馕叮?、變形桿菌（巧克力燒焦的臭味）、厭氧梭菌（***的惡臭味）、白色假絲酵母菌（酵母味）和放線菌（泥土味）等。 2．液體培養(yǎng)基 細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中有3種生長(zhǎng)現(xiàn)象：大多數(shù)細(xì)菌在液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)繁殖后呈均勻混濁；少數(shù)鏈狀排列的細(xì)菌如鏈球菌、炭疽芽胞桿菌等則呈沉淀生長(zhǎng)；枯草芽胞桿菌、結(jié)核分枝桿菌和銅綠假單胞菌等專性需氧菌一般呈表面生長(zhǎng)，常形成菌膜。 3．半固體培養(yǎng)基 半固體培養(yǎng)基主要用于細(xì)菌動(dòng)力試驗(yàn)，有鞭毛的細(xì)菌除了沿穿刺線生長(zhǎng)外，在穿刺線兩側(cè)也可見(jiàn)羽毛狀或云霧狀混濁生長(zhǎng)。無(wú)鞭毛的細(xì)菌只能沿穿刺線呈明顯的線狀生長(zhǎng)，穿刺線兩邊的培養(yǎng)基仍然澄清透明，為動(dòng)力試驗(yàn)陰性。 第三節(jié) 細(xì)菌的生物化學(xué)試驗(yàn) 各種細(xì)菌具有各自獨(dú)特的酶系統(tǒng)，因而對(duì)底物的分解能力不同，其代謝產(chǎn)物也不同。用生物化學(xué)方法測(cè)定這些代謝產(chǎn)物，可用來(lái)區(qū)別和鑒定細(xì)菌的種類。利用生物化學(xué)方法來(lái)鑒別不同細(xì)菌，稱為細(xì)菌的生物化學(xué)試驗(yàn)或稱生化反應(yīng)。生物化學(xué)試驗(yàn)的方法很多，主要有以下幾類。 一、碳水化合物的代謝試驗(yàn) 1．糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗(yàn) （1）原理：不同種類細(xì)菌含有發(fā)酵不同糖（醇、苷）類的酶，因而對(duì)各種糖（醇、苷）類的代謝能力也有所不同，即使能分解某種糖（醇、苷）類，其代謝產(chǎn)物可因菌種而異。檢查細(xì)菌對(duì)培養(yǎng)基中所含糖（醇、苷）降解后產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣的能力，可用以鑒定細(xì)菌種類。 (2)方法：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中（）~％（w/v）的特定糖（醇、苷）類。所使用的糖（醇、苷）類有很多種，根據(jù)不同需要可選擇單糖、多糖或低聚糖、多元醇和環(huán)醇等，見(jiàn)表641。將待鑒定的純培養(yǎng)細(xì)菌接種入試驗(yàn)培養(yǎng)基中，置35℃孵育箱內(nèi)孵育數(shù)小時(shí)到兩周（視方法及菌種而定）后，觀察結(jié)果。若用微量發(fā)酵管，或要求培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，應(yīng)注意保持其周圍的濕度，以免培養(yǎng)基干燥。 (3)結(jié)果：能分解糖（醇、苷）產(chǎn)酸的細(xì)菌，培養(yǎng)基中的指示劑呈酸性反應(yīng)（如酚紅變?yōu)辄S色），產(chǎn)氣的細(xì)菌可在小倒管（Durham小管）中產(chǎn)生氣泡，固體培養(yǎng)基則產(chǎn)生裂隙。不分解糖則無(wú)變化。 (4)應(yīng)用：糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗(yàn)，是鑒定細(xì)菌的生化反應(yīng)試驗(yàn)中最主要的試驗(yàn)，不同細(xì)菌可發(fā)酵 不同的糖（醇、苷）類，如沙門(mén)菌可發(fā)酵葡萄糖，但不能發(fā)酵乳糖，大腸埃希菌則可發(fā)酵葡萄糖和乳糖。即便是兩種細(xì)菌均可發(fā)酵同一種糖類，其發(fā)酵結(jié)果也不盡相同，如志賀菌和大腸埃希菌均可發(fā)酵葡萄糖，但前者僅產(chǎn)酸，而后者則產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，故可利用此試驗(yàn)鑒別細(xì)菌。 表641 常用于細(xì)菌糖發(fā)酵試驗(yàn)的糖、醇類 單糖 四碳糖：赤蘚糖 , 五碳糖：核糖 核酮糖 木糖 阿拉伯糖, 六碳糖：葡萄糖 果糖 半乳糖 甘露糖 雙糖 蔗糖（葡萄糖＋果糖） 乳糖（葡萄糖＋半乳糖） 麥芽糖（兩分子葡萄糖） 三糖 棉子糖（葡萄糖＋果糖＋半乳糖） 多糖 菊糖（多分子果糖） 淀粉 醇類 側(cè)金盞花醇 衛(wèi)茅醇 甘露醇 山梨醇 非糖類 肌醇 2．葡萄糖代謝類型鑒別試驗(yàn) (1)原理：細(xì)菌在分解葡萄糖的過(guò)程中，必須有分子氧參加的，稱為氧化型；能進(jìn)行無(wú)氧降解的為發(fā)酵型；不分解葡萄糖的細(xì)菌為產(chǎn)堿型。發(fā)酵型細(xì)菌無(wú)論在有氧或無(wú)氧環(huán)境中都能分解葡萄糖，而氧化型細(xì)菌在無(wú)氧環(huán)境中則不能分解葡萄糖。本試驗(yàn)又稱氧化發(fā)酵（O/F或Hugh－Leifson，HL）試驗(yàn)，可用于區(qū)別細(xì)菌的代謝類型。 (2)方法：挑取少許純培養(yǎng)物（不要從選擇性平板中挑?。┙臃N2支HL培養(yǎng)管中，（作為密封管），另一管不加（作為開(kāi)放管）。置35℃孵箱孵育48h以上。 (3)結(jié)果： 兩管培養(yǎng)基均不產(chǎn)酸（顏色不變）為陰性；兩管都產(chǎn)酸（變黃）為發(fā)酵型；加液體石蠟管不產(chǎn)酸，不加液體石蠟管產(chǎn)酸為氧化型。 (4)應(yīng)用：主要用于腸桿菌科與其它非發(fā)酵菌的鑒別。腸桿菌科、弧菌科細(xì)菌為發(fā)酵型，非發(fā)酵菌為氧化型或產(chǎn)堿型。也可用于鑒別葡萄球菌（發(fā)酵型）與微球菌（氧化型）。 3．甲基紅（MR）試驗(yàn) (1)原理：某些細(xì)菌在糖代謝過(guò)程中，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步被分解為甲酸、乙酸和琥珀酸等，加入甲基紅指示劑呈紅色。如細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，或產(chǎn)生的酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)（如醇、醛、酮、氣體和水），培養(yǎng)基pH在 ，加入甲基紅指示劑呈桔黃色。 (2)方法：將待試菌接種于葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水中，35℃孵育48h~96h后，于5ml培養(yǎng)基中滴加5~6滴甲基紅指示劑，立即觀察結(jié)果。 (3)結(jié)果判定：呈現(xiàn)紅色者為陽(yáng)性，桔黃色為陰性，桔紅色為弱陽(yáng)性。 (4)應(yīng)用：常用于腸桿菌科內(nèi)某些種屬的鑒別，如大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌，前者為陽(yáng)性，后者為陰性。腸桿菌屬和哈夫尼亞菌屬為陰性，而沙門(mén)菌屬、志賀菌屬、枸櫞酸桿菌屬和變形桿菌屬等為陽(yáng)性。 4．β－半乳糖苷酶試驗(yàn)（ONPG試驗(yàn)） (1)原理：乳糖發(fā)酵過(guò)程中需要乳糖通透酶和β－半乳糖苷酶才能快速分解。有些細(xì)菌只有半乳糖苷酶，因而只能遲緩發(fā)酵乳糖，所有乳糖快速發(fā)酵和遲緩發(fā)酵的細(xì)菌均可快速水解鄰硝基酚βD半乳糖苷（OnitrophenylβDgalactopyranoside,ONPG）而生成黃色的鄰硝基酚。用于枸櫞酸菌屬、亞利桑那菌屬與沙門(mén)菌屬的鑒別。 (2)方法：將待試菌接種于ONPG肉湯中，35℃水浴或孵箱孵育18~24h，觀察結(jié)果。 (3)結(jié)果：呈現(xiàn)亮黃色為陽(yáng)性，無(wú)色為陰性。 (4)應(yīng)用：可用于遲緩發(fā)酵乳糖細(xì)菌的快速鑒定，本法對(duì)于迅速及遲緩分解乳糖的細(xì)菌均可短時(shí)間內(nèi)呈現(xiàn)陽(yáng)性。埃希菌屬、枸櫞酸桿菌屬、克雷伯菌屬、哈夫尼亞菌屬、沙雷菌屬和腸桿菌屬等均為試驗(yàn)陽(yáng)性，而沙門(mén)菌屬、變形桿菌屬和普羅威登斯菌屬等為陰性。 5．VP試驗(yàn) (1)原理：測(cè)定細(xì)菌產(chǎn)生乙酰甲基甲醇的能力。某些細(xì)菌如產(chǎn)氣腸桿菌，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步脫羧形成乙酰甲基甲醇。在堿性條件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰，進(jìn)而與培養(yǎng)基中的精氨酸等含胍基的物質(zhì)結(jié)合形成紅色化合物。即VP試驗(yàn)陽(yáng)性。 (2)方法：將待檢菌接種于葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水中，35℃孵育24~48h，加入50g/Lα－萘酚（95％乙醇溶液），輕輕振搖試管， 400g/L KOH，輕輕振搖試管30s至1min，然后靜置觀察結(jié)果。 (3)結(jié)果：紅色者為陽(yáng)性，黃色或類似銅色為陰性。 (4)應(yīng)用：主要用于大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌的鑒別。本試驗(yàn)常與MR試驗(yàn)一起使用，一般情況下，前者為陽(yáng)性的細(xì)菌，后者常為陰性，反之亦然。但腸桿菌科細(xì)菌不一定都這樣規(guī)律，如蜂房哈夫尼亞菌和奇異變形桿菌的VP試驗(yàn)和MR試驗(yàn)常同為陽(yáng)性。 6．膽汁七葉苷水解試驗(yàn) （1）原理：在10%~40％膽汁存在下，測(cè)定細(xì)菌水解七葉苷的能力。七葉苷被細(xì)菌分解生成的七葉素，七葉素與培養(yǎng)基中的枸櫞酸鐵的二價(jià)鐵離子發(fā)生反應(yīng)形成黑色化合物。 (2)方法：將被檢菌接種于膽汁七葉苷培養(yǎng)基中，35℃孵育18~24h后，觀察結(jié)果。 (3)結(jié)果：培養(yǎng)基完全變黑為陽(yáng)性，不變黑為陰性。 (4)應(yīng)用：主要用于鑒別D群鏈球菌與其它鏈球菌的區(qū)別，以及腸桿菌科的某些種、某些厭氧菌（如脆弱擬桿菌等）的初步鑒別。D群鏈球菌本試驗(yàn)為陽(yáng)性。 7．淀粉水解試驗(yàn) (1)原理：產(chǎn)生淀粉酶的細(xì)菌能將淀粉水解為糖類，在培養(yǎng)基上滴加碘液時(shí)，可在菌落周圍出現(xiàn)透明區(qū)。 (2)方法：將被檢菌劃線接種于淀粉瓊脂平板或試管中，35℃孵育18~24h，加入革蘭碘液數(shù)滴，立即觀察結(jié)果。 (3)結(jié)果：陽(yáng)性反應(yīng)，菌落周圍有無(wú)色透明區(qū)，其它地方藍(lán)色；陰性反應(yīng)，培養(yǎng)基全部為藍(lán)色。 (4)應(yīng)用：用于白喉棒狀桿菌生物型的分型，重型淀粉水解試驗(yàn)陽(yáng)性，輕、中型陰性；芽胞桿菌屬菌種和厭氧菌某些種的鑒定。 8．甘油復(fù)紅試驗(yàn) (1)原理：甘油可被細(xì)菌分解生成丙酮酸，丙酮酸脫去羧基為乙醛，乙醛與無(wú)色的復(fù)紅生成醌式化合物，呈深紫紅色。 (2)方法：取被檢菌接種于甘油復(fù)紅肉湯培養(yǎng)基中，于35℃孵育，觀察2~8d。應(yīng)同時(shí)做陰性對(duì)照。 (3)結(jié)果：紫紅色為陽(yáng)性，與對(duì)照管顏色相同為陰性。 (4)應(yīng)用：主要用于沙門(mén)菌屬內(nèi)各菌種間的鑒別。傷寒沙門(mén)菌、甲（丙）型副傷寒沙門(mén)菌、豬霍亂沙門(mén)菌、孔道夫沙門(mén)菌和仙臺(tái)沙門(mén)菌本試驗(yàn)為陰性， 乙型副傷寒沙門(mén)菌結(jié)果不定，其它不常見(jiàn)沙門(mén)菌多數(shù)為陽(yáng)性。 9．葡萄糖酸氧化試驗(yàn) 　　(1)原理：某些細(xì)菌可氧化葡萄糖酸鉀，生成α酮基葡萄糖酸。α酮基葡萄糖酸是一種還原性物質(zhì)，可與班氏試劑起反應(yīng)，出現(xiàn)棕色或磚紅色的氧化亞銅沉淀。 (2)方法：將待檢菌接種于葡萄糖酸鹽培養(yǎng)基中(1ml)，置35℃孵育48h,加入班氏試劑1ml，于水浴中煮沸10min并迅速冷卻，觀察結(jié)果。 (3)結(jié)果：出現(xiàn)黃到磚紅色沉淀為陽(yáng)性。不變或仍為藍(lán)色為陰性。 　　(4)應(yīng)用：主要用于假單胞菌的鑒定和腸桿菌科菌分群。 二、氨基酸和蛋白質(zhì)的代謝試驗(yàn) 1．硫化氫試驗(yàn) (1)原理：某些細(xì)菌能分解含硫氨基酸生成硫化氫，與亞鐵離子或鉛離子結(jié)合形成黑色沉淀物。 (2)方法：將待檢菌接種于含硫化物及亞鐵離子的培養(yǎng)基或克氏雙糖鐵瓊脂（KIA）中，35℃孵育18~24h，觀察有無(wú)黑色沉淀出現(xiàn)?；蛴么姿徙U紙 條，懸掛于KIA管中（白色濾紙，根據(jù)試管大小裁剪適當(dāng)，在熱的50g/L醋酸鉛飽和水溶液中浸泡，然后于50~60℃烘干，121℃15min高壓滅菌備用）。醋酸鉛是最敏感的方法。 (3)結(jié)果：有黑色沉淀物為陽(yáng)性。 (4)應(yīng)用：主要用于鑒別腸桿菌科細(xì)菌，如沙門(mén)菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬、愛(ài)德華菌屬等為陽(yáng)性，其它菌屬大多為陰性。但沙門(mén)菌屬中亦有部分硫化氫陰性菌株，如甲型副傷寒、仙臺(tái)、豬霍亂沙門(mén)菌等。 2．明膠液化試驗(yàn) (1)原理：細(xì)菌分泌的胞外蛋白水解酶（明膠酶）能分解明膠，使明膠失去凝固能力而液化。 (2)方法：將待檢菌接種于明膠培養(yǎng)基中，35℃孵育24h到7d或更長(zhǎng)時(shí)間，每24h取出放入4℃冰箱約2h后，觀察有無(wú)凝固。 (3)結(jié)果：如無(wú)凝固，則表示明膠已被水解，液化試驗(yàn)陽(yáng)性。如凝固，則繼續(xù)培養(yǎng)。 (4)應(yīng)用：奇異變形桿菌、普通變形桿菌、沙雷菌屬和陰溝腸桿菌等到能液化明膠，腸桿菌科中的其它細(xì)菌很少液化明膠。有些厭氧菌如產(chǎn)氣莢膜梭菌、脆弱類桿菌等也能液化明膠。另外，許多假單胞菌也能產(chǎn)生明膠酶而使明膠液化。 3．吲哚試驗(yàn)（靛基質(zhì)試驗(yàn)） (1)原理：某些細(xì)菌有色氨酸酶，能分解色氨酸產(chǎn)生吲哚，吲哚與對(duì)二甲氨基苯甲醛形成紅色的玫瑰吲哚。 (2)方法：將待檢菌接種于富含色氨酸的蛋白胨水培養(yǎng)基中，35℃孵育24~48h，加入靛基質(zhì)試劑，觀察結(jié)果。 (3)結(jié)果：紅色為陽(yáng)性，無(wú)色為陰性。 (4)應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定，如大腸埃希菌與產(chǎn)氣腸桿菌，肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌等的鑒別。 4．苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn) (1)原理：測(cè)定細(xì)菌是否產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶。細(xì)菌產(chǎn)生的苯丙氨酸脫氨酶使苯丙氨酸脫氨后生成苯丙酮酸，加入三氯化鐵試劑后產(chǎn)生綠色反應(yīng)。若延長(zhǎng)時(shí)間，會(huì)引起退色。 (2)方法：將待檢菌大量接種入苯丙氨酸培養(yǎng)基中，35℃孵育18~24h，滴加100g/L三氯化鐵試劑4~5滴，立即觀察菌落生長(zhǎng)處有無(wú)綠色出現(xiàn)。 (3)結(jié)果：有綠色出現(xiàn)為陽(yáng)性。 (4)應(yīng)用：變形桿菌屬、普羅威登菌屬、摩根菌屬均為陽(yáng)性，腸桿菌科其它細(xì)菌均為陰性。 5．氨基酸脫羧酶試驗(yàn) (1)原理：某些細(xì)菌可產(chǎn)生氨基酸脫羧酶使氨基酸脫羧生成胺和二氧化碳。由于胺的生成使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，可用指示劑指示出來(lái)。 (2)方法：將待檢菌分別接種于1支氨基酸（賴氨酸，鳥(niǎo)氨酸或精氨酸）脫羧酶試驗(yàn)管和1支氨基酸脫羧酶對(duì)照管（無(wú)氨基酸）， 的無(wú)菌石蠟油，35℃孵育1~4d，觀察結(jié)果。 (3)結(jié)果：若為溴甲酚紫指示劑，則試驗(yàn)管紫色為陽(yáng)性，黃色為陰性，對(duì)照管應(yīng)為黃色。 (4)應(yīng)用：主要用于某些細(xì)菌種間的鑒別，如賴氨酸用于產(chǎn)氣腸桿菌（陽(yáng)性）與陰溝腸桿菌（陰性）；鳥(niǎo)氨酸用于陰溝腸桿菌（陽(yáng)性）和克雷伯菌（陰性）；精氨酸用于陰溝腸桿菌（陽(yáng)性）和產(chǎn)氣腸桿菌（陰性）等。 6．精氨酸雙水解酶試驗(yàn) (1)原理：精氨酸經(jīng)兩次水解后,生成鳥(niǎo)氨酸、氨及二氧化碳。鳥(niǎo)氨酸又在脫羧酶的作用下生成腐胺。氨及腐胺均為堿性物質(zhì)，故可使培養(yǎng)基變堿，用 指示劑指示出來(lái)。