09級細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)-資料下載頁
2025-04-04 23:01本頁面
【正文】 于正常細(xì)胞，使其在直方圖上表現(xiàn)為一個熒光強(qiáng)度比正常細(xì)胞要小的峰（亞二倍體峰），即凋亡細(xì)胞DNA對PI可染性降低。44. 簡述TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡的實驗原理細(xì)胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個漸進(jìn)的分階段的過程，染色體DNA首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為50300kb的大片段。然后大約30 ﹪的染色體DNA在Ca 178。+和Mg178。+依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，在核小體單位之間被隨機(jī)切斷，形成180～200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而產(chǎn)生的一系列DNA的3’OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3’末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3’OH形成，很少能夠被染色。45. 簡述流式細(xì)胞術(shù)PI染色進(jìn)行細(xì)胞周期分析的原理? PI ,即碘化丙錠 ,可以與細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA結(jié)合 ,采用RNA抑制劑將RNA消化后 ,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測到的與DNA結(jié)合的PI的熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)DNA含量的多少。由于細(xì)胞周期各時相的DNA含量不同 ,通常正常細(xì)胞的G1 /G0期具有二倍體細(xì)胞的DNA含量 (2N) ,而G2 /M期具有四倍體細(xì)胞的DNA含量 (4N) ,而S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。因此 ,通過流式細(xì)胞術(shù)PI染色法對細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)行檢測時 ,可以將細(xì)胞周期各時相區(qū)分為G1 /G0期 ,S期和G2 /M期 ,并可通過特殊軟件計算各時相的百分率。值得注意的是 ,PI不能通過細(xì)胞膜完整的細(xì)胞4細(xì)胞凋亡：凋亡（或程序性細(xì)胞死亡）是一個生理性的細(xì)胞自我毀滅的過程，在胚胎發(fā)育、生物體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及多細(xì)胞生物防御外在及內(nèi)在傷害方面均起著非常重要的作用。凋亡過程的紊亂，可能與許多疾病的發(fā)生有直接或間接的關(guān)系，如腫瘤、自身免疫性疾病、神經(jīng)退行性變及局部損傷等。能夠誘發(fā)細(xì)胞凋亡的因素很多，如射線、能夠引起染色體損傷的藥物、細(xì)胞自身表達(dá)的一些受體分子等。 4顯微結(jié)構(gòu):，細(xì)胞膜保持完整一直到形成凋亡小體, 染色質(zhì)聚集、分塊、位于核膜上呈半月狀，細(xì)胞器無明顯變化,細(xì)胞體積固縮變小,凋亡小體形成4凋亡小體4細(xì)胞壞死:胞質(zhì)內(nèi)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、崩解，結(jié)構(gòu)脂滴游離、空泡化，蛋白質(zhì)顆粒增多，核發(fā)生固縮或斷裂在蘇木精/伊紅染色,胞質(zhì)呈均一的深伊紅色，原有的微細(xì)結(jié)構(gòu)消失。50、熒光激發(fā)濾色鏡分哪幾類?各自的激發(fā)波長是多少？激發(fā)濾色鏡為觀察不同性質(zhì)的物體所設(shè)計的濾色鏡或濾色鏡組，通常可分為紫外激發(fā)(U激發(fā))、紫色激發(fā)(V激發(fā))、藍(lán)色激發(fā)(B激發(fā))和綠色激發(fā)(G激發(fā))等四種。5簡述細(xì)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征有哪些？（見表四）①染色質(zhì)聚集、分塊、位于核膜上，胞質(zhì)凝縮，最后核斷裂， ②凋亡小體內(nèi)有結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞器，還有凝縮的染色體，可被鄰近細(xì)胞吞噬消化，因始終有膜封閉，沒有內(nèi)溶物釋放，故不會引起炎癥；③凋亡細(xì)胞中仍需要合成一些蛋白質(zhì)。④核酸內(nèi)切酶活化，導(dǎo)致染色質(zhì)DNA在核小體連接部位斷裂，形成約200bp整數(shù)倍的核酸片段，凝膠電泳圖譜呈梯狀；⑤凋亡通常是生理性變化 5根據(jù)標(biāo)本染色的不同如何選擇濾光片：染成藍(lán)色或綠色的標(biāo)本使用紅色濾光片、染成紅色的標(biāo)本使用綠色濾光片、染成黃色或棕色的標(biāo)本使用藍(lán)色濾光片、染成紫色的標(biāo)本使用綠色濾光片、染成藍(lán)——紫色的標(biāo)本使用黃色濾光片5細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義。細(xì)胞凋亡作為生理性主動性的過程，能確保正常生長，發(fā)育，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，發(fā)揮積極的防御功能。5熒光顯微鏡使用的注意事項：1)長時間的激發(fā)光照射標(biāo)本，會發(fā)生熒光衰減和消失現(xiàn)象，故應(yīng)盡可能縮短照射(觀察)時間。暫時不觀察時，可用擋板遮蓋激發(fā)光源。2)在油浸觀察時，應(yīng)采用“無熒光油”，在使用U和V激發(fā)方式觀察時更應(yīng)注意。香柏油可產(chǎn)生青色熒光。3)標(biāo)本所發(fā)的熒光較弱，觀察時應(yīng)盡可能在較暗的室內(nèi)條件下進(jìn)行。使用帶有遮光罩的目鏡時可將其撥出使用，以防雜光進(jìn)人干擾。4)熒光顯微照相時，因曝光時間相對較長，可采用感光度較快的膠片 5)避免直視紫外線光源，將紫外線防護(hù)板(黃色)裝在載物臺前以防紫外線損傷視網(wǎng)膜。 6)電源應(yīng)裝置穩(wěn)壓器，電壓不穩(wěn)會降低汞燈的使用壽命并影響鏡檢效果。7)汞燈光源點亮后至少點燈15分，關(guān)閉后等待35分再開5光學(xué)顯微鏡基本結(jié)構(gòu)光學(xué)顯微鏡在結(jié)構(gòu)上分為光學(xué)系統(tǒng)和機(jī)械裝置兩個部分。 光學(xué)系統(tǒng)主要包括目鏡、物鏡、聚光器、光闌及光源等部分。機(jī)械裝置主要包括鏡筒、鏡柱、載物臺、鏡座、粗細(xì)調(diào)節(jié)螺旋等部分5熒光顯微鏡在細(xì)胞生物學(xué)研究中有什么應(yīng)用？5比較放大率與分辨率的含義。放大率就是放大倍數(shù)，是指被檢物體經(jīng)物鏡、目鏡放大后，人眼所看到的最終圖象的大小與原物體大小的比值，是物鏡和目鏡放大倍數(shù)的乘積，如目鏡為 10倍，物鏡為40倍，則放大倍數(shù)為 40 X 10倍（放大400倍）。好的顯微鏡最大可放大2000倍，可分辨相距1X10－6cm的兩點。分辨率又稱“鑒別率”或“分辨本領(lǐng)”，是衡量顯微鏡性能的一個重要參數(shù)。正常人眼在照明良好的情況下，若小于這個距離，就分辨不清是兩個物體點，而被誤認(rèn)為是一點。因此。顯微鏡也是如此，其最小分辨距離也是有一定限度的。5試論述細(xì)胞凋亡的檢測方法。Annexin V聯(lián)合PI法。TUNEL法。細(xì)胞凋亡的主要檢查手段。形態(tài)學(xué)檢查 Ladders實驗 流式細(xì)胞儀檢查 Annexin V聯(lián)合PI檢測細(xì)胞凋亡。TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死的區(qū)別：起因 細(xì)胞凋亡是生理或病理性的；細(xì)胞壞死是病理性變化或劇烈損傷。范圍 細(xì)胞凋亡是單個散在的細(xì)胞；細(xì)胞壞死是大片組織或成群細(xì)胞。細(xì)胞膜 細(xì)胞凋亡是保持完整一直到形成調(diào)亡小體；細(xì)胞壞死是破損。染色質(zhì)是凝聚在核膜下呈半月狀；細(xì)胞壞死呈絮狀。細(xì)胞器 細(xì)胞凋亡無明顯變化；細(xì)胞壞死是腫脹和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)崩解。細(xì)胞體積 細(xì)胞凋亡時固縮變??；細(xì)胞壞死時腫脹變大。凋亡小體 細(xì)胞凋亡有，被鄰近細(xì)胞或巨噬細(xì)胞吞噬；細(xì)胞壞死無，細(xì)胞自溶?；蚪MDNA 細(xì)胞凋亡有控降解，電泳圖譜呈梯狀；細(xì)胞壞死隨機(jī)降解，電泳圖譜呈涂抹狀。蛋白質(zhì)合成 細(xì)胞凋亡有；細(xì)胞壞死無。調(diào)節(jié)過程 細(xì)胞凋亡受基因控制；細(xì)胞壞死被動進(jìn)行。炎癥反應(yīng) 細(xì)胞凋亡無，不釋放細(xì)胞內(nèi)容物；細(xì)胞壞死有，釋放內(nèi)容物。12 / 12
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