09級(jí)細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)(編輯修改稿)
2025-05-01 23:01 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反．結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。22．凍存液的作用是什么？（1）保存種子細(xì)胞，以便隨時(shí)取用。這是保存細(xì)胞的最主要目的。（2）減少細(xì)胞被微生物污染的危險(xiǎn)性。（3）減少細(xì)胞之間交叉污染的危險(xiǎn)性。（4）減少細(xì)胞因傳代培養(yǎng)而引起的遺傳變異和形態(tài)改變。（5）避免有限細(xì)胞系出現(xiàn)衰老或惡性轉(zhuǎn)化。降低人力和物力。23．為什么細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，細(xì)胞懸液逸出槽外時(shí)要重做？公式中除以4因?yàn)橛?jì)數(shù)了4個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)。 公式中乘以2因?yàn)榧?xì)胞懸液于染液是1：1稀釋。 公式中乘以104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為： （長）（寬）（高）＝ 而 1ml＝1000mm3 24. 在細(xì)胞培養(yǎng)中如何防止污染？（1）使用抗生素清除細(xì)菌和真菌。預(yù)防用藥一般用雙抗生素，污染后清除用藥需采用大于用量5~10倍的沖洗法。于加藥后作用24~48小時(shí)，再換常規(guī)培養(yǎng)液。（2）用MRA（mycoplasma removal agent）處理細(xì)胞，每4天換一次液，連續(xù)處理15天清除支原體效果好。另外將受支原體污染的細(xì)胞放置在41℃作用5—10h．最長不超過18h，以殺滅支原體．25. 培養(yǎng)細(xì)胞的生長測定方法1,細(xì)胞計(jì)數(shù)法2,臺(tái)盼蘭染色法3,MTT比色法4,細(xì)胞生長曲線法5,[3H]TdR([3H]胸腺嘧啶核苷）摻入法6,BrdU (5bromo2—deoxyuridine，5溴脫氧尿嘧啶核苷 ）摻入法26. 如何估計(jì)是否傳代及傳代的方式？估計(jì):(1)細(xì)胞沒有生長到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前，不要急于傳代。(2)原代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞多為混雜生長，上皮樣細(xì)胞和成纖維樣細(xì)胞并存的情況很多見．傳代時(shí)不同的細(xì)胞有不同的消化時(shí)間，因而要注意觀察及時(shí)進(jìn)行處理。并可根據(jù)不同細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的不同耐受時(shí)間而分離和純化所需要的細(xì)胞。另外，早期傳代培養(yǎng)的細(xì)胞較已經(jīng)建系的培養(yǎng)消化時(shí)間相對(duì)較長。吹打細(xì)胞時(shí)動(dòng)作要輕巧盡可能減少對(duì)細(xì)胞的損傷。 (3)首次傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些．使細(xì)胞能盡快適應(yīng)新環(huán)境而利于細(xì)胞生存和增殖。隨消化分離而脫落的組織塊也可一并傳入新的培養(yǎng)瓶。細(xì)胞傳代過程需注意的問題：操作全過程注意無菌操作；胰酶消化時(shí)間要適度；吹打細(xì)胞時(shí)用力要適度，盡量減少氣泡。在傳代期培養(yǎng)時(shí)應(yīng)注意：為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在傳代后早期凍存（不出10代內(nèi)凍存）。少數(shù)細(xì)胞系在此期可能發(fā)生自發(fā)或誘發(fā)轉(zhuǎn)化，獲得不死性而成為無限細(xì)胞系，此時(shí)細(xì)胞核型多變成異倍體。方式:：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后 再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除l／2～2／3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。2 .半懸浮生長細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞）此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹 打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。 采用酶消化法傳代。％的胰蛋白酶液。27．組織細(xì)胞取材及培養(yǎng)的基本要求取材的組織最好盡快培養(yǎng)。取材時(shí)應(yīng)嚴(yán)格無菌操作。防止細(xì)胞機(jī)械損傷：取材和原代細(xì)胞制作時(shí)．耍用鋒利的器械，避免組織干燥：要仔細(xì)去除所取材料上的血液(血塊)、脂肪、壞死組織及結(jié)締組織，切碎組織時(shí)應(yīng)避免組織干燥，可在含少量培養(yǎng)液的器皿中進(jìn)行。原代培養(yǎng)，特別是正常細(xì)胞的培養(yǎng)，應(yīng)采用營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)液。一般來講．胚胎組織較成熟個(gè)體的組織容易培 養(yǎng)．分化低的較分化高的組織容易生長、腫瘤組織較正常組織容易培養(yǎng)。取材時(shí)應(yīng)盡量選用易培養(yǎng)的組織進(jìn)行培養(yǎng)。為了便于以后鑒別原代組織的來源和觀察細(xì)胞體外培養(yǎng)與原組織的差異性．原代取材時(shí)要同時(shí)留好組織學(xué)標(biāo)本和電鏡標(biāo)本，并詳細(xì)記錄。28. 簡述原代細(xì)胞培養(yǎng)方法及注意事項(xiàng)?常用的有兩種: 細(xì)胞培養(yǎng)法 和 組織塊法細(xì)胞培養(yǎng)法(1)按組織的消化分離法收獲細(xì)胞。(2）在消化過程中．可隨時(shí)吸取少量消化液在鏡下觀察。(3)已過濾的消化液，800一1000rpm，低速離心5min后，去除上清，加含血清培養(yǎng)液，輕輕吹打形成細(xì)胞懸液。如果用膠原酶或EDTA應(yīng)先用緩沖液洗。組織塊法（1）取材、修剪、組織剪或切成1mm3左右的小塊。(2)將剪切好的組織小塊．用眼科鑷送入培養(yǎng)瓶內(nèi)。25ml培養(yǎng)瓶(）以20一30小塊為宜。(3）放置2—4h待組織小塊貼附后．將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放、靜止培養(yǎng)。[注意事項(xiàng)]組織塊接種后l～3天，由于游出細(xì)胞數(shù)很少．組織塊的粘貼不牢固．在觀察相移動(dòng)過程中要注意動(dòng)作輕巧．盡量不要引起液體的振蕩而產(chǎn)生對(duì)組織塊的沖擊力使其漂起。在原代培養(yǎng)的1一2d內(nèi)要持別注意觀察，是否有細(xì)菌、霉菌的污染．一旦發(fā)現(xiàn)，要及時(shí)清除，以防給培養(yǎng)箱內(nèi)的其它細(xì)胞帶來污染。 對(duì)原代培養(yǎng)要及時(shí)觀察．發(fā)現(xiàn)細(xì)胞游出后要照像記錄。原代培養(yǎng)3—5d需換液一次．去除漂浮的組織塊和殘留的血細(xì)胞，因?yàn)橐哑〉慕M織塊及很多細(xì)胞碎片含有有毒物質(zhì)，影響原代細(xì)胞的生長，要及時(shí)清除。注意事項(xiàng):1組織塊接種后l～3天，由于游出細(xì)胞數(shù)很少．組織塊的粘貼不牢固．在觀察相移動(dòng)過程中要注意動(dòng)作輕巧．盡量不要引起液體的振蕩而產(chǎn)生對(duì)組織塊的沖擊力使其漂起。2在原代培養(yǎng)的1一2d內(nèi)要持別注意觀察，是否有細(xì)菌、霉菌的污染．一旦發(fā)現(xiàn)，要及時(shí)清除，以防給培養(yǎng)箱內(nèi)的其它細(xì)胞帶來污染。3原代培養(yǎng)3—5d需換液一次．去除漂浮的組織塊和殘留的血細(xì)胞，因?yàn)橐哑〉慕M織塊及很多細(xì)胞碎片含有有毒物質(zhì)，影響原代細(xì)胞的生長，要及時(shí)清除。29．判斷細(xì)胞健康的標(biāo)準(zhǔn)是什么？1形態(tài)學(xué)2細(xì)胞染色體分析3同工酶檢查4DNA指紋技術(shù)檢測5抗原標(biāo)記6細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)30. 培養(yǎng)過程中支原體和病毒污染的特點(diǎn)是什么？支原體是介于細(xì)菌與病毒之間能獨(dú)立生活的最小微生物，一般過濾除菌無法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件下生存，對(duì)青霉素有抗藥性。多吸附于細(xì)胞表面或散在于細(xì)胞之間。培養(yǎng)細(xì)胞受支原體污染后，部分敏感細(xì)胞可見細(xì)胞生長增殖變慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細(xì)胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時(shí)處理，還會(huì)產(chǎn)生交叉污染。流式細(xì)胞術(shù)是二十世紀(jì)七十年代發(fā)展起來的高科學(xué)技術(shù),流式細(xì)胞儀集計(jì)算機(jī)技術(shù)、激光技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)于一體,同時(shí)具有分析和分選細(xì)胞功能。它不僅可測量細(xì)胞大小、內(nèi)部顆粒的性狀, 還可檢測細(xì)胞表面和細(xì)胞漿抗原、細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA含量等,可對(duì)群體細(xì)胞在單細(xì)胞水平上進(jìn)行分析,在短時(shí)間內(nèi)檢測分析大量細(xì)胞, 并收集、儲(chǔ)存和處理數(shù)據(jù), 進(jìn)行多參數(shù)定量分析。能夠分類收集(
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