09級(jí)細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)(已改無錯(cuò)字)
2023-05-05 23:01:17 本頁面
【正文】 分選)某一亞群細(xì)胞,分選純度＞95%。與傳統(tǒng)熒光鏡檢查相比，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)， 成為當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)。在血液學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科廣泛應(yīng)用。流式細(xì)胞儀的工作原理：待測(cè)樣品制成單個(gè)細(xì)胞的懸液，經(jīng)特異性熒光染料對(duì)細(xì)胞（或表面抗原等）染色后放入上樣管中，在清潔氣體的壓力下將待測(cè)樣品壓入流動(dòng)室，與此同時(shí)，不含細(xì)胞的磷酸鹽緩沖液（鞘液）在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測(cè)樣品流成一定角度，這樣，鞘液就能夠包繞著樣品高速流動(dòng)，組成一個(gè)圓形的流束，待測(cè)細(xì)胞在鞘液的包被下單行排列，依次通過檢測(cè)區(qū)域。流式細(xì)胞儀通常以激光作為發(fā)光源。經(jīng)過聚焦整形后的光束，垂直照在樣品流上，被熒光染色的細(xì)胞在激光束的照射下，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。 待測(cè)樣品制成單個(gè)細(xì)胞的懸液，經(jīng)特異性熒光染料對(duì)細(xì)胞（或表面抗原等）染色后放入上樣管中，在清潔氣體的壓力下將待測(cè)樣品壓入流動(dòng)室，與此同時(shí)，不含細(xì)胞的磷酸鹽緩沖液（鞘液）在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測(cè)樣品流成一定角度，這樣，鞘液就能夠包繞著樣品高速流動(dòng)，組成一個(gè)圓形的流束，待測(cè)細(xì)胞在鞘液的包被下單行排列，依次通過檢測(cè)區(qū)域。流式細(xì)胞儀通常以激光作為發(fā)光源。經(jīng)過聚焦整形后的光束，垂直照在樣品流上，被熒光染色的細(xì)胞在激光束的照射下，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。 流式細(xì)胞儀的工作原理是將待測(cè)細(xì)胞放入樣品管中，在氣體的壓力下進(jìn)入充滿鞘液的流動(dòng)室。在鞘液的約束下細(xì)胞排成單列由流動(dòng)室的噴嘴噴出，形成細(xì)胞柱。通過對(duì)流動(dòng)液體中排列成單列的細(xì)胞進(jìn)行逐個(gè)檢測(cè)，得到該細(xì)胞的光散射和熒光指標(biāo)，分析出其體積、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等物理及化學(xué)特征。 ，在流式細(xì)胞儀的激光束照射下，會(huì)產(chǎn)生哪三大信號(hào)？這三大信號(hào)分別代表什么？1前向角散射，即FSC，與細(xì)胞直徑成正相關(guān)，所以我們平時(shí)上機(jī)的時(shí)候，有時(shí)用FSC做閾值，排除碎片及其它顆粒，避免干擾。 2 側(cè)向角散射，即SSC，是指與激光束正交90度方向的散射信號(hào)，它對(duì)細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更敏感，可以提供細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)及顆粒性質(zhì)的信息. 這兩種信號(hào)同時(shí)被前向光電二極管和90176。方向的光電倍增管接收。前向光散射信號(hào)在前向小角度進(jìn)行檢測(cè)，這種信號(hào)基本上反映了細(xì)胞體積的大小。3熒光信號(hào)的接受方向與激光束垂直，經(jīng)過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個(gè)不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)。 這些熒光信號(hào)的強(qiáng)度代表了所測(cè)細(xì)胞膜表面抗原的強(qiáng)度或其核內(nèi)物質(zhì)的濃度，經(jīng)光電倍增管接收后可轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，再通過模／數(shù)轉(zhuǎn)換器，將連續(xù)的電信號(hào)轉(zhuǎn)換為可被計(jì)算機(jī)識(shí)別的數(shù)字信號(hào)。計(jì)算機(jī)把所測(cè)量到的各種信號(hào)進(jìn)行計(jì)算機(jī)處理，將分析結(jié)果顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上，也可以打印出來，還可以數(shù)據(jù)文件的形式存儲(chǔ)在硬盤上以備日后的查詢或進(jìn)一步分析。，鞘液有哪些作用？鞘液的作用有二：一是約束樣品使之在噴嘴中心以提高測(cè)量精度；二是防止樣品靠近噴孔壁以避免堵塞噴孔。在這種約束作用下，細(xì)胞排成單列一個(gè)跟隨一個(gè)地在鞘液包裹下由流動(dòng)室下面的噴嘴中心噴出，形成細(xì)胞液柱。液柱與入射的高度聚焦的激光束相交，此時(shí)，細(xì)胞上的熒光染料被激發(fā)而產(chǎn)生特異性熒光。在與入射激光和液柱都垂直的方向設(shè)置有熒光測(cè)量系統(tǒng)，包括透鏡、光闌、濾片、檢測(cè)器等，將細(xì)胞的熒光信號(hào)變成電信號(hào)輸出到計(jì)算機(jī)，用專用軟件進(jìn)行分析。，評(píng)價(jià)一個(gè)樣品制備的優(yōu)劣，有哪三個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)？①細(xì)胞的密度，不能低于1106/ml ②非特異熒光，不超過1％.③細(xì)胞碎片和聚集體，不能出現(xiàn)肉眼可見的團(tuán)塊。1HLAB27分析2細(xì)胞周期分析3凋亡分析4淋巴細(xì)胞亞群分析5白血病分型6細(xì)胞因子分析7血小板分析8干細(xì)胞分析9流式細(xì)胞儀在其它方面的應(yīng)用。HLAB27基因表達(dá)在所有含核的細(xì)胞上，尤其是淋巴細(xì)胞的表面含量豐富。HLAB27軟件首先在FSCFL2的點(diǎn)圖上確定CD3強(qiáng)陽性細(xì)胞群體的位置，設(shè)定一個(gè)CD3+T淋巴細(xì)胞門，然后再根據(jù)FSC設(shè)定光散射門，去除FSC過大或過小的細(xì)胞，確保門內(nèi)至少有50%的CD3+T淋巴細(xì)胞，這樣通過二者的結(jié)合，將隨后進(jìn)行的分析嚴(yán)格地定位在T淋巴細(xì)胞上。在檢測(cè)之前，儀器已經(jīng)CaliBRITE beads和HLAB27 calibration beads調(diào)試成功，并通過試劑批號(hào)的后綴確定了decision marker的位置。（見表三）？校準(zhǔn)儀器的軟件名稱？流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)顯示通常有哪幾種方式？、處理、分析，但由于數(shù)據(jù)大，又缺乏直觀性，不利于觀察各參數(shù)及其相互的關(guān)系。因此，將數(shù)據(jù)用圖形顯 示更直觀，然后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，這是FCM結(jié)果分析中最常用的分析方法。FCM數(shù)據(jù)顯示通常有一維直方圖、二維點(diǎn)圖、二維密度圖、二維等高圖、假三維圖等。（安裝488和635nm激光）能同時(shí)檢測(cè)到的六大參數(shù)分別是什么？41. 簡(jiǎn)述流式細(xì)胞儀的特點(diǎn)和檢測(cè)范圍。1分析速度快2 多參數(shù)3當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)4精度高42. 在使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析時(shí)，為什么要進(jìn)行光譜重疊的校正？當(dāng)細(xì)胞攜帶兩種熒光素如PE和FITC, 受激光激發(fā)而發(fā)射出兩種不同波長(zhǎng)的熒光時(shí)，理論上，可選擇濾片使每種熒光僅被相應(yīng)的檢測(cè)器檢測(cè)到，而不會(huì)檢測(cè)到另一種熒光。但由于目前所使用的各種熒光染料都是寬發(fā)射譜性質(zhì)，雖然它們之間各自發(fā)射峰值各不相同，但發(fā)射譜范圍有一定的重疊，F(xiàn)ITC探測(cè)器會(huì)探測(cè)到少量的PE光譜，而PE探測(cè)器則檢測(cè)到較多的FITC光譜。克服這種誤差的最有效方法是使用熒光補(bǔ)償電路，利用標(biāo)準(zhǔn)已知樣品或熒光小珠，可合理設(shè)置熒光信號(hào)的補(bǔ)償值。 43. 簡(jiǎn)述磷脂酰絲氨酸外翻分析(Annexin V法)聯(lián)合PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的原理。磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。AnnexinV是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將AnnexinV進(jìn)行熒光素（FITC、PE）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的AnnexinV作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將AnnexinV與PI匹配使用，就可以將正常細(xì)胞、凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開主要是通過PI與細(xì)胞核DNA結(jié)合，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)DNA含量。亞二倍體峰的出現(xiàn)，實(shí)際上是由于細(xì)胞凋亡時(shí)DNA含量低
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