細(xì)胞生物學(xué)試驗(yàn)篇(編輯修改稿)
2025-05-01 23:50 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 過程中應(yīng)注意什么？實(shí)驗(yàn)四 吖啶橙(acridine orange)染色 觀察口腔上皮熒光【目的要求】熟悉熒光顯微鏡的原理及使用方法。觀察熒光染料染色后結(jié)合物發(fā)出的熒光?！緦?shí)驗(yàn)原理】吖啶橙熒光染料可與細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA結(jié)合。其吸收光譜405nm，發(fā)射的熒光光譜是530～640nm，因此，吖啶橙和不同的細(xì)胞成分結(jié)合后，可發(fā)射紅橙黃綠藍(lán)各色熒光?！緦?shí)驗(yàn)用品】1．器材：熒光顯徽鏡、載玻片、蓋玻片、染色缸、牙簽；2．材料：口腔黏膜上皮細(xì)胞臨時制片；3．試劑:1)。A液：NaH2PO4H20 ；B液，Na2HPO47H20 ；、NaCl 。2)％吖啶橙原液：。％吖啶橙染液：％ PBS液稀釋。3）95％乙醇【方法與步驟】1．用牙簽刮取口腔上皮細(xì)胞涂在干凈載玻片上；2．95％乙醇溶液固定5min；3．％吖啶橙染液染色5min；4．用PBS緩沖液緩慢沖洗；5．加蓋玻片鏡檢?！居^察結(jié)果】描述你所觀察到的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，并繪圖，表明熒光的顏色。實(shí)驗(yàn)五 植物細(xì)胞骨架的光學(xué)顯微鏡觀察【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆罩参锛?xì)胞骨架的制備方法，并用光鏡觀察洋蔥內(nèi)皮細(xì)胞的骨架網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。 【實(shí)驗(yàn)原理】細(xì)胞骨架(cytoskeleton)，是細(xì)胞內(nèi)以蛋白質(zhì)纖維為主要成分的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，根據(jù)蛋白質(zhì)纖維的直徑、組成成分和組裝結(jié)構(gòu)的不同可分為微絲、微管和中等纖維。細(xì)胞骨架對于維持細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及細(xì)胞運(yùn)動、物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換、信號傳導(dǎo)和細(xì)胞分裂等有重要的作用。本實(shí)驗(yàn)采用去垢劑TritonX100的緩沖液處理植物材料時，可將細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)和大部分蛋白質(zhì)抽提掉，但細(xì)胞骨架系統(tǒng)的蛋白卻被保存下來，后者用考馬斯亮藍(lán)R250染色，在光學(xué)顯微鏡下可見一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 【實(shí)驗(yàn)用品】：顯微鏡、載玻片、蓋玻片、鑷子、滴管、擦鏡紙、50ml燒杯； ：洋蔥鱗莖；：1） ；索倫森（Sorensen）磷酸緩沖液溶液A：Na2HPO42H2O 溶液B：KH2PO4 對照下表取一定體積的溶液A，再加入足夠的溶液B至總體積達(dá)100ml，即得到所需pH的緩沖液。溶液ApH溶液ApH溶液ApH2）M緩沖液 ：50mmol/L (pH)咪唑、 50mmol/L KCl、 、 1mmol/L EGTA、、1mmol/L巰基乙醇、 4mmol/L甘油、1mol/LHCl調(diào)pH 3）1%TritonX100：用M緩沖液配制。4）3%戊二醛：。5）%考馬斯亮藍(lán)R250染液：、7ml冰醋酸、。6）50％，70％，95％乙醇7）叔丁醇、正丁醇、二甲苯、中性樹膠【實(shí)驗(yàn)步驟】1. 取材：～1cm2，浸入裝有磷酸緩沖液（）的小燒杯中，處理5～10分鐘。2. 去垢處理：棄去PBS緩沖液，用吸水紙吸凈剩余的PBS，加適量1%Triton X100，使液體充分浸泡材料，并立即放入37℃恒溫箱或水浴鍋中處理30分鐘。3. 沖洗：吸去1%Triton X100，立即加入M緩沖液輕輕沖洗3次，每次3～5分鐘。4. 固定：用吸管將M緩沖液吸盡，加入3%戊二醛，固定10～20分鐘。5. 沖洗：吸去3%戊二醛固定液，用磷酸緩沖液（）沖洗3次，每次3～5分鐘。6. 染色：吸去PBS緩沖液，%考馬斯亮藍(lán)R250染料，染色10～20分鐘。7. 制片：吸去染料，用水沖洗（注意不要將材料丟失）。將洋蔥表皮伸展鋪平于載玻片上，加蓋蓋玻片。8. 鏡檢：將制好的片子置于低倍鏡下，可見到規(guī)則排列的長方形洋蔥表皮細(xì)胞輪廓，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見到被染成藍(lán)色的粗細(xì)不等的分枝狀結(jié)構(gòu)，這便是細(xì)胞骨架。轉(zhuǎn)高倍鏡繼續(xù)觀察，調(diào)節(jié)細(xì)螺旋可見到細(xì)胞骨架的立體結(jié)構(gòu)。在有樣品的50ml燒杯中，順序通過如下藥物：50％、70％、95％乙醇，95％乙醇＋叔丁醇（1：1），叔丁醇（每級5～10min）；或正丁醇、正丁醇、二甲苯、二甲苯（每級5～10分鐘），然后撈取樣品，平展于載玻片上，經(jīng)鏡檢，效果好的可加一滴中性樹膠，蓋上蓋玻片?！咀鳂I(yè)與思考】1. 繪出洋蔥細(xì)胞的骨架網(wǎng)絡(luò)分布。2．根據(jù)M緩沖液的成分，分析其作用。3．通過實(shí)驗(yàn)過程，推測你所觀察到的細(xì)胞骨架屬于胞質(zhì)骨架中的哪種類型，為什么？實(shí)驗(yàn)六 PEG法誘導(dǎo)細(xì)胞融合【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 了解細(xì)胞融合的原理和過程；2. 初步掌握利用PEG介導(dǎo)動物細(xì)胞融合的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。【實(shí)驗(yàn)原理】細(xì)胞融合，即在自然條件下或利用人工法 (生物的、物理的、化學(xué)的)，使兩個或兩個以上的細(xì)胞合并成一個具有雙核或多核細(xì)胞的過程。由于不僅同種細(xì)胞可以融合，種間遠(yuǎn)緣細(xì)胞也能融合，甚至于動植細(xì)胞也能合二為一，因此細(xì)胞融合技術(shù)目前較廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和醫(yī)學(xué)研究等各個領(lǐng)域，并且取得顯著的成績?；瘜W(xué)融合方法一般使用聚乙二醇(PEG)誘導(dǎo)細(xì)胞在體外進(jìn)行融合。商品PEG的相對分子質(zhì)量有2006000范圍內(nèi)的各種規(guī)格，它們均可用作細(xì)胞融合劑。普遍認(rèn)為PEG分子能改變各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞接觸點(diǎn)處質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生疏散和重組，由于兩細(xì)胞接口處雙分子層質(zhì)膜的相互親和以及彼此的表面張力作用，從而使細(xì)胞發(fā)生融合。促進(jìn)細(xì)胞融合的效力，必須采用較高濃度的PEG溶液，但在高濃度PEG溶液下，細(xì)胞可能因脫水而受到顯著的破壞。因此，選擇合適的PEG分子量，濃度及作用時間是PEG融合技術(shù)的關(guān)鍵。
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