【文章內(nèi)容簡介】 如 DNA、 RNA和蛋白質(zhì)等 )的原子布陣和一些生物結(jié)構(gòu) (如生物膜 、 細胞壁等 )的原子排列 ,而不需要特別的制樣技術(shù) ，并且探測過程對樣品無損傷 —— 納米科學水平 。 掃描隧道顯微鏡的優(yōu)越之處： 第二節(jié) 細胞組分的分析方法 一、用超離心技術(shù)分離細胞器與生物大分子及其 b 復合物 二、細胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、 酶、糖與脂類等的顯 b 示方法 三、特異蛋白抗原的定位與定性 四、細胞內(nèi)特異核酸的定位與定性 一、用超離心技術(shù)分離細胞器與生物大分子及其合物 各種離心技術(shù) —— 離心是研究亞細胞成分和生物大分子的基本手段。 1924年 svdberg發(fā)明了世界上第一臺分析超速離心機。 離心機： 普通： 8000rpm以下； 高速： 8000~25000rpm； 超速： 25000rpm以上，達十幾萬 rpm。 一般步驟 ： 勻漿化 離心處理 收集分析 （一）差速離心 Differential centrifugation ? 主要是采取逐漸提高離心速度的方法分離不同大小的細胞器 。 起始的離心速度較低 ， 讓較大的顆粒沉降到管底 ， 小的顆粒仍然懸浮在上清液中 。 收集沉淀 ， 改用較高的離心速度離心懸浮液 ， 將較小的顆粒沉降 ， 以此類推 ， 達到分離不同大小顆粒的目的 。 差速離心 低速離心 中速離心 高速離心 超高速離心 細胞勻漿 細胞 核仁 細胞骨架 大細胞器 小細胞器 核糖體 大分子 等密度離心法： 按細胞組分的浮力密度不同進行分離的方法。適用于大小、形態(tài)相似而密度不同的組分。常將樣品通過高濃度的蔗糖或氯化銫的密度梯度沉降在達到與自身密度相等的位置就停滯不再向下沉降。 ?常用介質(zhì)： 氯化銫 、 蔗糖 、 多聚蔗糖 。 密度梯度離心分離溶酶體、線粒體和微體 CsCl 密度梯度離心分離 DNA 密度大于 ? 原理： 利用一些顯色劑與所檢測物質(zhì)中一些特殊基團特異性結(jié)合的特征 ， 通過顯色劑在細胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細胞中的分布和含量 。 ? 利用這種方法對細胞的各種成分幾乎都能顯示，包括糖類、脂類、核酸、酶等。 二、 細胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、 酶、糖與脂類等的顯示方法 核酸 顯示方法－－－－ Feulgen反應 Feulgen和 Rossenbeck (1924)發(fā)明，對 DNA的反應具有高度專一性。 原理 : 標本經(jīng)稀鹽酸水解后， DNA分子中的嘌呤堿基被解離，從而在核糖的一端出現(xiàn)了醛基。 Schiff試劑中的 無色品紅 與醛基反應，形成含有醌基的化合物，醌基為發(fā)色團，呈現(xiàn)出紫紅色。 Feulgen反應 糖類顯示方法 －－－ 過碘酸雪夫反應（ periodic acid Schiff reaction,PAS反應） 基本原理 ： 過碘酸的氧化作用先使糖分子的乙二醇基變?yōu)橐叶┗笳呃^而與Schiff試劑（無色亞硫酸品紅復合物）結(jié)合，形成紫紅色反應產(chǎn)物。 酶組織化學染色法 基本原理： 是利用酶對其相應底物的水解、氧化等作用，然后再使底物的反應產(chǎn)物與某種試劑發(fā)生反應，形成 沉淀 或 有色的最終產(chǎn)物，借此檢測該酶在組織切片或細胞內(nèi)的分布及活性強弱。 Electron micrograph of a cell showing the location of a particular enzyme (nucleotide diphosphatase) in the Golgi apparatus. A thin section of the cell was incubated with a substrate that formed an electrondense precipitate upon reaction with the enzyme 脂類物質(zhì)包括脂肪和類脂。標本用甲醛固定，冷凍切片，脂類保存較好。多用蘇丹染料、油紅 O、尼羅藍等溶于脂類的染料染色，使脂質(zhì)呈色。也可用四氧化鋨（ OSO4）染色，脂肪酸或膽堿可使 OSO4還原為 OSO2而呈黑色。 2． 脂類顯示方法 二十世紀 70年代以來，免疫學的迅速發(fā)展為細胞生物學的研究提供了強有力的手段，特別是在細胞內(nèi)特異蛋白的定位與定性方面，單克隆抗體與其它一些檢測手段相結(jié)合發(fā)揮了重要作用。 免疫細胞化學技術(shù) 與免疫電鏡是最常見的研究細胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子定位的重要技術(shù) 。 三、特異蛋白抗原的定位與定性 免疫細胞化學技術(shù)（ Immunocytochemistry） 利用抗原和抗體的結(jié)合具有高敏感性和特異性的特點，用已知的經(jīng)過標記的抗體檢測組織與細胞中相應抗原的方法。 常用的標記方法： 1)熒光標記：異硫氰酸熒光素（ FITC）、羅丹明 2)酶標記：辣根過氧化物酶（ HRP） 3)膠體金標記：即金的水溶液，具有一般溶液的特 性，用它與抗體標記后，經(jīng)抗原抗體 反應可定位抗原的存在。 ?間接法 ?直接法 將帶有標記的抗體與抗原反應 ，顯示出抗原存在的部位 在抗體抗原初級反應的基礎上 ， 再用帶標記的次級抗體與初級抗體反應 ， 從而使初級反應得到放大 ， 增強顯示效果 Antigen presenting Cell Enzymeconjugated Primary Antibody Substratechromogen solution ?直接法 將帶有標記的抗體與抗原反應 ，顯示出抗原存在的部位 間接免疫細胞化學法的原理示意圖 次級 抗體 初級 抗體 標記物 第一抗體（一抗） 第二抗體（二抗） Primary Antibody Enzymeconjugated Secondary Antibody Antigen presenting Cell Substratechromogen solution 間接法 （一）免疫熒光技術(shù) 免疫熒光技術(shù) 就是將免疫學方法 （ 抗原抗體特異結(jié)合 ） 與熒光標記技術(shù)相結(jié)合用來研究特異蛋白抗原在細胞內(nèi)分布的方法 。 常用的螢光素有異硫氰酸熒光素 (FITC)、 羅丹明 (rhodamine)等 。 實質(zhì) 就是用結(jié)合有 熒光素 的抗體與組織內(nèi)抗原反應，在熒光顯微鏡下觀察抗原的存在部位。也可分為直接法和間接法。 它主要包括熒光抗體的制備， 標本的處理，免疫染色和觀察記錄等過程。標本處理