【正文】 Hela細(xì)胞（左）、 CHO細(xì)胞（右）的培養(yǎng) 正常 細(xì)胞培養(yǎng) 的世代數(shù)有限，只有癌細(xì)胞和發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞才能無限生長下去。所謂 轉(zhuǎn)化 即是指正常細(xì)胞在某種因子的作用下發(fā)生突變而具有癌性的細(xì)胞。 細(xì) 胞 工 程 (cell engineering) ? 概念 ： 是指應(yīng)用現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的理論與方法，按照人們的需要和設(shè)計(jì)，在細(xì)胞水平上的遺傳操作，重組細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和內(nèi)含物，以改變生物的結(jié)構(gòu)和功能，即通過細(xì)胞融合、核質(zhì)移植、染色體或基因移植以及組織和細(xì)胞培養(yǎng)等方法，快速繁殖和培養(yǎng)出人們所需要的新物種的生物工程技術(shù)。 ? 類型： 就技術(shù)范圍而言，大致有細(xì)胞融合技術(shù)、細(xì)胞拆合技術(shù)、細(xì)胞組織培養(yǎng)技術(shù)和胚胎移植技術(shù)等。 （一） 細(xì)胞融合的概念 細(xì)胞融合（ cell fusion）又稱細(xì)胞雜交（ cell hybridization）是指在自然條件下或人工方法（物理，化學(xué)，生物等方法）將不同種生物或同種生物不同類型兩個(gè)或多個(gè)真核細(xì)胞合并成一個(gè)雙核或多核細(xì)胞的生物學(xué)現(xiàn)象和過程。 細(xì) 胞 融 合 同核融合細(xì)胞 ： 基因型相同的細(xì)胞融合成的雜交細(xì)胞稱為同核體 (homokaryon)； 異核融合細(xì)胞 ： 來自不同基因型的雜交細(xì)胞則稱為異核體 (heterokaryon)。 兩個(gè)細(xì)胞正在融合 細(xì)胞膜的流動(dòng)性是動(dòng)物細(xì)胞融合的生物學(xué)基礎(chǔ)。細(xì)胞融合就是利用細(xì)胞膜的這一特性，通過對(duì)參與融合的細(xì)胞施加生物、化學(xué)、或物理誘導(dǎo)因素，使細(xì)胞膜的脂類分子有序排列發(fā)生改變；當(dāng)誘導(dǎo)因素解除后，細(xì)胞膜恢復(fù)原有的有序結(jié)構(gòu)，在恢復(fù)過程中便可誘導(dǎo)相接觸的細(xì)胞發(fā)生融合。 動(dòng)物細(xì)胞融合的原理 細(xì)胞融合過程 細(xì)胞融合可分為４個(gè)過程： １ .細(xì)胞的接觸 ２ .細(xì)胞質(zhì)膜的融合 ３ .細(xì)胞質(zhì)的重組 ４ .遺傳物質(zhì)的選擇 細(xì) 胞 融 合 過 程 許多病毒都具有凝集動(dòng)物細(xì)胞并促使凝集的動(dòng)物細(xì)胞發(fā)生融合的能力。如皰疹病毒，牛痘病毒，雞瘟病毒和仙臺(tái)病毒等．其中常用的是經(jīng)紫外線照射滅活的仙臺(tái)病毒． 誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法 仙臺(tái)病毒 紫外線 喪失感染活性 （不感染細(xì)胞 ） 保留融合活性 （誘導(dǎo)細(xì)胞融合） ３ . 電激介導(dǎo)的細(xì)胞融合 其中電誘導(dǎo)細(xì)胞融合和ＰＥＧ誘導(dǎo)細(xì)胞融合是動(dòng)物細(xì)胞融合的常用方法。 ２ .化學(xué)介導(dǎo)的細(xì)胞融合（如 PEG） 細(xì)胞融合不僅可用于基礎(chǔ)研究 ， 而且還有重要的應(yīng)用價(jià)值 ， 如動(dòng)植物育種和制取單克隆抗體 等 。 A 低 產(chǎn) 抗倒伏 B 高 產(chǎn) 易倒伏 AB 雜交細(xì)胞 高產(chǎn) 抗倒伏 細(xì)胞 融合 (雜交 ) ? 在生命科學(xué)中應(yīng)用價(jià)值極大的單克隆抗體的制備技術(shù)就是在細(xì)胞融合技術(shù)上發(fā)展起來的．單克隆抗體的誕生，導(dǎo)致了免疫學(xué)技術(shù)的革命．這項(xiàng)技術(shù)或１９８４年諾貝爾醫(yī)學(xué)及生理學(xué)獎(jiǎng)． 應(yīng)用： ?疾病的論斷和治療 (生物導(dǎo)彈 ) ?生物大分子的鑒定、定位和分離純化 ?細(xì)胞器的鑒定、定位和分離 ?特定細(xì)胞或病毒的鑒定、定位和分離 二 單克隆抗體技術(shù) 榮獲 1984年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) 發(fā)明單克隆抗體技術(shù) 杰尼 Niels K. Jerne 丹麥 巴塞爾免疫研究所 1911年 1994年 科勒 Gees . K246。hler 德國 巴塞爾免疫研究所 1946年 1995年 米爾斯坦 C233。sar Milstein 英國 英國醫(yī)學(xué)研究委員會(huì) 分子生物實(shí)驗(yàn)室 1927年 三 . 單克隆抗體的概念和原理 由單一克隆的 雜交瘤細(xì)胞 分泌的抗體，只針對(duì)于一個(gè)抗原決 定簇 —— 單克隆抗體 抗原分子表面具有特殊立體構(gòu)型和免疫活性的化學(xué)基團(tuán)稱為抗原決定簇。 脾細(xì)胞 (B淋巴細(xì)胞 ) 骨髓瘤細(xì)胞 雜交瘤細(xì)胞 分泌抗體 長命 分泌抗體 短命 長命 不分泌抗體 （二） HAT培養(yǎng)基篩選 的原理 免疫脾細(xì)胞 經(jīng)抗原免疫的 BALB/c小鼠的脾臟 小鼠骨髓瘤細(xì)胞 次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶(HGPRT),胸腺嘧啶激酶（ TK） － 缺陷型 親本細(xì)胞 主途徑：是由糖和氨基酸合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA， 葉酸 作為重要的輔酶參與這一合成過程。 可被氨基喋呤 阻斷 輔助途徑：是在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情況下，經(jīng) 次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（ HGPRT） 和胸腺嘧啶核苷激酶（ TK） 的催化作用合成 DNA。 如細(xì)胞含有此兩種酶則可啟動(dòng)補(bǔ)救途徑。 細(xì)胞 DNA合成一般有兩條途徑 : HAT培養(yǎng)基篩選 : H, 次黃嘌呤 。 T, 胸腺嘧啶 H T 外源性途徑 (旁路途徑 ) DNA 內(nèi)源性途徑 (主要途徑 ) 糖和氨基酸 二氫葉酸還原酶 胸腺嘧啶激酶 ( TK ) (Thymidine kinase) 外源性途徑 (旁路途徑 ) A A, 氨基喋呤 。 可阻斷內(nèi)源性的 DNA的合成。 脾細(xì)胞 (B淋巴細(xì)胞 ) 骨髓瘤細(xì)胞 雜交瘤細(xì)胞 脾細(xì)胞 /?脾細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞 / ?骨髓瘤細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞 脾細(xì)胞 不能長期存活 不能長期存活 單克隆抗體制備示意圖 三 細(xì)胞拆合及顯微操作技術(shù) 細(xì)胞拆合方法： 可以分為物理法和化學(xué)法兩種類型 。 物理法 ：用機(jī)械方法或短波光把細(xì)胞核去掉或失 活 ， 然后用微吸管吸取其它細(xì)胞的核 ， 注入去核的細(xì)胞質(zhì)中 ， 組成新的雜交細(xì)胞 。 這種核移植必須用顯微操縱儀進(jìn)行操作 。 化學(xué)法 ：用松胞素 B處理細(xì)胞 ， 細(xì)胞出現(xiàn)排核現(xiàn)象 ， 再結(jié)合離心技術(shù) ， 將細(xì)胞分拆為核體和胞質(zhì)體兩部分 。 由于核體外表包有一層細(xì)胞膜和少量胞漿 ， 因而在 PEG或仙臺(tái)病毒的介導(dǎo)下 ， 核體可同另一胞質(zhì)體融合 ， 形成重組細(xì)胞 。 細(xì)胞拆合： 就是把核與質(zhì)分離開來，然后把不同來源的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核相互配合，形成核質(zhì)雜交細(xì)胞。 顯微操作技術(shù) micromanipulation technique ? 在倒置顯微鏡下利用顯微操作器進(jìn)行細(xì)胞或早期胚胎操作的一種方法 。 顯微操作器是用以控制顯微注射針在顯微鏡視野內(nèi)移動(dòng)的機(jī)械裝置 。 顯微操作儀 現(xiàn)在顯微操作裝置的設(shè)計(jì)越來越精密，已經(jīng)有可能對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行解剖和注入微量物質(zhì)（如核酸分子片段）。 注射吸管 固定吸管 DNA 思考題： 1. 如何分離分析細(xì)胞組分？ 2. 什么是原位雜交？ 3. 單克隆抗體技術(shù)原理？ 4. 原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、 5. 細(xì)胞系、細(xì)胞株、細(xì)胞融合（細(xì)胞雜交）