【正文】 Hela細胞（左）、 CHO細胞（右）的培養(yǎng) 正常 細胞培養(yǎng) 的世代數(shù)有限，只有癌細胞和發(fā)生轉化的細胞才能無限生長下去。所謂 轉化 即是指正常細胞在某種因子的作用下發(fā)生突變而具有癌性的細胞。 細 胞 工 程 (cell engineering) ? 概念 ： 是指應用現(xiàn)代細胞生物學、發(fā)育生物學、遺傳學和分子生物學的理論與方法，按照人們的需要和設計，在細胞水平上的遺傳操作，重組細胞的結構和內含物，以改變生物的結構和功能，即通過細胞融合、核質移植、染色體或基因移植以及組織和細胞培養(yǎng)等方法，快速繁殖和培養(yǎng)出人們所需要的新物種的生物工程技術。 ? 類型： 就技術范圍而言，大致有細胞融合技術、細胞拆合技術、細胞組織培養(yǎng)技術和胚胎移植技術等。 （一） 細胞融合的概念 細胞融合（ cell fusion）又稱細胞雜交（ cell hybridization）是指在自然條件下或人工方法（物理，化學，生物等方法）將不同種生物或同種生物不同類型兩個或多個真核細胞合并成一個雙核或多核細胞的生物學現(xiàn)象和過程。 細 胞 融 合 同核融合細胞 ： 基因型相同的細胞融合成的雜交細胞稱為同核體 (homokaryon)； 異核融合細胞 ： 來自不同基因型的雜交細胞則稱為異核體 (heterokaryon)。 兩個細胞正在融合 細胞膜的流動性是動物細胞融合的生物學基礎。細胞融合就是利用細胞膜的這一特性，通過對參與融合的細胞施加生物、化學、或物理誘導因素，使細胞膜的脂類分子有序排列發(fā)生改變；當誘導因素解除后，細胞膜恢復原有的有序結構，在恢復過程中便可誘導相接觸的細胞發(fā)生融合。 動物細胞融合的原理 細胞融合過程 細胞融合可分為４個過程： １ .細胞的接觸 ２ .細胞質膜的融合 ３ .細胞質的重組 ４ .遺傳物質的選擇 細 胞 融 合 過 程 許多病毒都具有凝集動物細胞并促使凝集的動物細胞發(fā)生融合的能力。如皰疹病毒，牛痘病毒，雞瘟病毒和仙臺病毒等．其中常用的是經紫外線照射滅活的仙臺病毒． 誘導細胞融合的方法 仙臺病毒 紫外線 喪失感染活性 （不感染細胞 ） 保留融合活性 （誘導細胞融合） ３ . 電激介導的細胞融合 其中電誘導細胞融合和ＰＥＧ誘導細胞融合是動物細胞融合的常用方法。 ２ .化學介導的細胞融合（如 PEG） 細胞融合不僅可用于基礎研究 ， 而且還有重要的應用價值 ， 如動植物育種和制取單克隆抗體 等 。 A 低 產 抗倒伏 B 高 產 易倒伏 AB 雜交細胞 高產 抗倒伏 細胞 融合 (雜交 ) ? 在生命科學中應用價值極大的單克隆抗體的制備技術就是在細胞融合技術上發(fā)展起來的．單克隆抗體的誕生，導致了免疫學技術的革命．這項技術或１９８４年諾貝爾醫(yī)學及生理學獎． 應用： ?疾病的論斷和治療 (生物導彈 ) ?生物大分子的鑒定、定位和分離純化 ?細胞器的鑒定、定位和分離 ?特定細胞或病毒的鑒定、定位和分離 二 單克隆抗體技術 榮獲 1984年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎 發(fā)明單克隆抗體技術 杰尼 Niels K. Jerne 丹麥 巴塞爾免疫研究所 1911年 1994年 科勒 Gees . K246。hler 德國 巴塞爾免疫研究所 1946年 1995年 米爾斯坦 C233。sar Milstein 英國 英國醫(yī)學研究委員會 分子生物實驗室 1927年 三 . 單克隆抗體的概念和原理 由單一克隆的 雜交瘤細胞 分泌的抗體，只針對于一個抗原決 定簇 —— 單克隆抗體 抗原分子表面具有特殊立體構型和免疫活性的化學基團稱為抗原決定簇。 脾細胞 (B淋巴細胞 ) 骨髓瘤細胞 雜交瘤細胞 分泌抗體 長命 分泌抗體 短命 長命 不分泌抗體 （二） HAT培養(yǎng)基篩選 的原理 免疫脾細胞 經抗原免疫的 BALB/c小鼠的脾臟 小鼠骨髓瘤細胞 次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核苷轉移酶(HGPRT),胸腺嘧啶激酶（ TK） － 缺陷型 親本細胞 主途徑：是由糖和氨基酸合成核苷酸，進而合成DNA， 葉酸 作為重要的輔酶參與這一合成過程。 可被氨基喋呤 阻斷 輔助途徑：是在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情況下，經 次黃嘌呤磷酸核糖轉化酶（ HGPRT） 和胸腺嘧啶核苷激酶（ TK） 的催化作用合成 DNA。 如細胞含有此兩種酶則可啟動補救途徑。 細胞 DNA合成一般有兩條途徑 : HAT培養(yǎng)基篩選 : H, 次黃嘌呤 。 T, 胸腺嘧啶 H T 外源性途徑 (旁路途徑 ) DNA 內源性途徑 (主要途徑 ) 糖和氨基酸 二氫葉酸還原酶 胸腺嘧啶激酶 ( TK ) (Thymidine kinase) 外源性途徑 (旁路途徑 ) A A, 氨基喋呤 。 可阻斷內源性的 DNA的合成。 脾細胞 (B淋巴細胞 ) 骨髓瘤細胞 雜交瘤細胞 脾細胞 /?脾細胞 骨髓瘤細胞 / ?骨髓瘤細胞 骨髓瘤細胞 脾細胞 不能長期存活 不能長期存活 單克隆抗體制備示意圖 三 細胞拆合及顯微操作技術 細胞拆合方法： 可以分為物理法和化學法兩種類型 。 物理法 ：用機械方法或短波光把細胞核去掉或失 活 ， 然后用微吸管吸取其它細胞的核 ， 注入去核的細胞質中 ， 組成新的雜交細胞 。 這種核移植必須用顯微操縱儀進行操作 。 化學法 ：用松胞素 B處理細胞 ， 細胞出現(xiàn)排核現(xiàn)象 ， 再結合離心技術 ， 將細胞分拆為核體和胞質體兩部分 。 由于核體外表包有一層細胞膜和少量胞漿 ， 因而在 PEG或仙臺病毒的介導下 ， 核體可同另一胞質體融合 ， 形成重組細胞 。 細胞拆合： 就是把核與質分離開來，然后把不同來源的細胞質和細胞核相互配合，形成核質雜交細胞。 顯微操作技術 micromanipulation technique ? 在倒置顯微鏡下利用顯微操作器進行細胞或早期胚胎操作的一種方法 。 顯微操作器是用以控制顯微注射針在顯微鏡視野內移動的機械裝置 。 顯微操作儀 現(xiàn)在顯微操作裝置的設計越來越精密，已經有可能對細胞核進行解剖和注入微量物質（如核酸分子片段）。 注射吸管 固定吸管 DNA 思考題： 1. 如何分離分析細胞組分？ 2. 什么是原位雜交？ 3. 單克隆抗體技術原理？ 4. 原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、 5. 細胞系、細胞株、細胞融合（細胞雜交）