【正文】 狀尚未發(fā)生很大的變化 。 b .具有二倍體遺傳性 ， 在一定程度上能反映體內(nèi)狀態(tài) 。 缺點： 胞成分組成的 ， 比較復(fù)雜 ， 具有異質(zhì)性 ，在分析細胞生物學(xué)特性是比較困難 。 些原因 ， 細胞群生長效果不好 。 傳代培養(yǎng)： （ Subculture） 原代培養(yǎng)的細胞進行分離培養(yǎng) （ 由于空間和營養(yǎng)的緣故 ） 的過程 ，也就是將原代培養(yǎng)的細胞從一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另一個培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng) 。 細胞培養(yǎng)在實驗研究中的應(yīng)用 一 、 用于藥物的測試 用培養(yǎng)細胞檢測藥物的優(yōu)點： 1. 減少種屬差異： 2. 具有組織特異性： 3. 培養(yǎng)細胞具有均一的遺傳背景： 4. 獲得實驗結(jié)果迅速： 藥物的檢測 1. 藥物劑量的確定： 2. 細胞的形態(tài)和增殖生長對藥物的反應(yīng) 3. 觀察藥物作用的時間 。 4. 抗癌藥物的研究 。 5. 細胞培養(yǎng)在雜交瘤技術(shù)中的應(yīng)用 二 、 細胞培養(yǎng)在雜交瘤中的應(yīng)用 雜交瘤技術(shù)，是醫(yī)學(xué)生物領(lǐng)域中的一項技術(shù)革命，它是生物工程的重要組成部分。 雜 交瘤技術(shù)主要有： 細胞融合 、 抗體篩選 克隆化培養(yǎng) 三部分組成一套完整的技術(shù)體系 三 、 單克隆抗體的大量制備 1. 加大培養(yǎng)容器 ：大量培養(yǎng)方法，可大量收集培養(yǎng)上清。同時需對抗體進行濃縮。 2. 體內(nèi)移植法 ：取同系雌性小鼠（ 68周齡），腹腔注射 ，一周后腹腔內(nèi)注射 107雜交細胞。雜交瘤細胞在腹腔內(nèi)可增殖并產(chǎn)生腹水，腹水中可含大量的抗體（達 mg水平）， 原位雜交組織化學(xué)技術(shù) 的基本方法 一、核酸分子雜交技術(shù) 1961年 Hall開拓了液相核酸雜交技術(shù)的研究，其基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基順序，通過堿基對之間非共價鍵的形成，出現(xiàn)穩(wěn)定的雙鏈區(qū)，形成雜交的雙鏈。 按其作用方式可大致分為： 固相雜交 液相雜交 液相雜交： 液相雜交是指參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中，即 待測核酸鏈和探針雙方均在溶液中所進行的雜交。 固相雜交：是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈固定在固體的支持物上，另一條參加反應(yīng)的核酸鏈游離在溶液中。即 待測核酸鏈固定于固相支持物上 (如尼龍膜 )、探針在溶液中所進行的雜交。分為膜上印跡雜交與原位雜交 常用的有硝酸纖維素濾膜，其它如尼龍膜、乳膠顆粒和微孔板等）， 液相分子雜交技術(shù)包括： 吸附雜交 發(fā)光液相雜交 液相夾心雜交 復(fù)性速率液相分子雜交 固相雜交包括： 菌落原位雜交（ colony in situ hybridization）、 斑點雜交法（ Dot blot）、 Southern印跡雜交（ Southern blot）、Northern印跡雜交（ Northern blot） 組織原位雜交（ Tissue in situ hybridization）， 即原位雜交組織化學(xué)技術(shù)和原位雜交免疫細胞化學(xué)技術(shù)。 斑點及狹縫印跡雜交（ Dot and slot blot） 直接將核酸樣品點樣于濾膜上，然后與探針進行雜交的方法稱之。 菌落雜交： 系細菌裂解釋放出 DNA，然后進行雜交。 將菌落（噬斑）原位轉(zhuǎn)移至濾膜上，原位裂解、變性，然后進行分子雜交。 Southern印跡雜交法： 是以鑒定 DNA中某一特定的基因片段， DNA片段經(jīng)電泳分離后，原位轉(zhuǎn)印至膜，再進行分子雜交的技術(shù)。 Northern印跡雜交法： RNA經(jīng)電泳分離后，原位轉(zhuǎn)印至膜，再進行分子雜交的技術(shù)。 是用以檢測某一特定的 RNA片段的。 Western blot （蛋白質(zhì)的原位測定技術(shù)） 蛋白質(zhì)經(jīng)電泳分離后，原位轉(zhuǎn)印至膜，再進行免疫反應(yīng)或親和、結(jié)合反應(yīng)的測定技術(shù) 但以上這些雜交都只能證明該病原體、細胞或組織中是否存在待測的核酸而不能證明該核酸分子在細胞或組織中存在的部位。 組織原位雜交（ Tissue in situ hybridization）， 即原位雜交組織化學(xué)技術(shù)和原位雜交免疫細胞化學(xué)技術(shù)。 可對 核酸在細胞中進行定位。 Orth（ 1970）應(yīng)用 3H標記的兔乳頭狀瘤病毒cRNA探針與兔乳頭狀瘤組織的冰凍切片進行雜交，首次用原位雜交檢測了病毒 DNA在細胞中的定位，但當時的工作多采用冰凍組織切片或培養(yǎng)細胞，探針均采用同位素標記。 二．探針 廣義 帶有可檢測的標記物能與特定的靶分子發(fā)生特異性相互作用的分子。 核酸探針 指用同位素或其他標記物標記的特定已知的核酸分子。 ★ ★ 根據(jù)標記方法的不同可粗略分為 放射性探針 和 非放射性探針 兩類。 根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不同可分為 DNA探針、RNA探針、 cDNA探針、 cRNA探針和寡核苷酸探針等。 DNA探針還有單鏈 DNA（ Single stranded, ssDNA）和雙鏈 DNA（ Double stranded, dsDNA）之分。 (1) DNA探針 Genomic DNA : 盡可能選用基因的 編碼序列 (外顯子 ), 避免使用內(nèi)含子 及其它非編碼序列 cDNA： 無內(nèi)含子及高度重復(fù)序列 (2) RNA探針 優(yōu)點： 雜交穩(wěn)定性與效率高、 特異性強、 本底低 缺點： 易降解， poly A干擾 (3) 寡核苷酸探針 最適于點突變檢測 選擇原則基本同 PCR引物設(shè)計長 1850nt, GC含量 4060% ,與非靶序列同源性不超過70%或連續(xù) 8個以上相同堿基 . 原位雜交組織化學(xué)技術(shù) 在生命科學(xué)的研究中可視為一項革命性的技術(shù)。 它使它們的研究從器官、組織和細胞水平走向分子水平 。為各個學(xué)科的研究帶來突破性的進展。 其中特別突出的是 細胞或組織的基因表達、染色體分析、病毒診斷和發(fā)育生物學(xué) 。 一、原位雜交組織化學(xué)技術(shù) 二、原位雜交組織化學(xué)技術(shù)的由來及發(fā)展 原位雜交組織（或細胞）化學(xué)技術(shù)簡稱原位雜交（ In situ hybridization），屬于固相核酸分子雜交的范疇。但它區(qū)別于固相核酸分子雜交中的任何一種核酸分子雜交技術(shù)。 1969年美國耶魯大學(xué) Gall和 Pardue首先用 爪蟾核糖體基因探針與其卵母細胞雜交 ，確定該基因定位于卵母細胞的核仁中。與此同時，有人相繼利用同位素標記核酸探針進行了細胞或組織的基因定位，從而創(chuàng)造了原位雜交細胞或組織化學(xué)技術(shù)。 由于同位素標記探針具有放射性既污染環(huán)境，又對人體有害，且受半衰期限制等缺點，科學(xué)工作者們開始探索用非放射性的標記物標記核酸探針進行原位雜交。 熒光素標記 cRNA探針做原位雜交 2， 4二硝基苯甲醛（ DNP） 標記 DNA探針 ，使該DNA探針具有抗原性，然后用兔抗 DNP的抗體來識別雜交后的探針，最后經(jīng)免疫過氧化物酶的方法來定位雜交探針。 生物素標記技術(shù)又叫酶促生物素標記技術(shù)。 探針標記 原位雜交組織化學(xué)技術(shù)的基本方法 由于核酸探針的種類和標記物的不同，大致可分為： ① 雜交前準備，包括固定、取材、玻片和組織的處理，如何增強核酸探針的穿透性、減低背景染色等； ② 雜交； ③ 雜交后處理； ④ 顯示（ visual－ ization）：包括放射性自顯影和非放射性標記的顯色。 （一）固定 原位雜交組織化學(xué)技術(shù)（ In Situ Hybridization Histochemistry, ISHH）在固定劑的應(yīng)用和選擇上 應(yīng)兼顧到三個方面： 保持細胞結(jié)構(gòu)， 最大限度地保持細胞內(nèi) DNA或 RNA的水平； 使探針易于進入細胞或組織。 ● ● ● 最常用的是多聚甲醛 。和其它的固定劑（如戊二醛）不同，多聚甲醛不會與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，因而不會影響探針穿透入細胞或組織。 常采用的方法 是將組織固定于 4%多聚甲醛磷酸緩沖液中 1～ 2h，在冷凍前浸入 15%蔗糖溶液中，置 4℃ 冰箱過夜，次日切片?；虮４嬖谝旱?。 組織也可在取材后直接置入液氮冷凍，切片后才將其浸入 4%多聚甲醛約 10min，空氣干燥后保存在 70℃ 。 ● ● ● （二）玻片和組織切片的處理 1．玻片的處理玻片包括蓋片和載片應(yīng)用熱肥皂刷洗，自來水清洗干凈后，置于清潔液中浸泡 24h，清水洗凈烘干， 95%酒精中浸泡 24h后蒸餾水沖洗、烘干，烘箱溫度最好在 150℃ 或以上過夜以去除任何RNA酶。蓋玻片在有條件時最好用硅化處理，錫箔紙包裹無塵存放。 應(yīng)用 粘附劑預(yù)先涂抹 在玻片上，干燥后待切片時應(yīng)用，以保證在整個實驗過程中切片不致脫落。常用的粘附劑有鉻礬 明膠液，多聚賴氨酸液具有較好的粘附效果，但價格昂貴，需進口。 2．增強組織的通透性和核酸探針的穿透性 此步驟根據(jù)應(yīng)用固定劑的種類、組織的種類、切片的厚度和核酸探針的長度而定。 比如用戊二醛固定的組織由于其與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接就需要應(yīng)用較強的增強組織通透性的試劑。 常用的方法： 如應(yīng)用稀釋的酸洗滌、去垢劑（ detergent）或稱清洗劑 Triton X100、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶和淀粉酶（ diastase）等。 蛋白酶 K（ Proteinase K）的消化作用 應(yīng)用于蛋白的消化，其濃度及孵育時間視組織種類、應(yīng)用固定劑種類、切片的厚薄而定。 蛋白酶 K還具有消化包圍著靶 DNA的蛋白質(zhì)的作用，從而提高雜交信號。 預(yù)雜交（ Prehybridization） 是減低背景染色的一種有效手段。 預(yù)雜交液和雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖（ Dextran sulphate）。將組織切片浸入預(yù)雜交液中可達到封閉非特異性雜交點的目的，從而減低背景染色。 （三）雜交（ Hybridisation） 雜交是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片。 在此過程中核酸探針進入細胞或組織與其內(nèi)的靶核苷酸相結(jié)合。 因此，雜交是 ISHH中關(guān)鍵的而且是最重要的一個環(huán)節(jié) 。 為獲得滿意的實驗結(jié)果，在雜交這一實驗過程中必須注意以下的環(huán)節(jié) ： 1．把握探針的濃度 ：最佳原則應(yīng)是應(yīng)用最低探針濃度以達到與靶核苷酸的最大飽和結(jié)合度為目的。即探針濃度必須給予該實驗最大的信 /噪比值。 2. 把握探針的長度：一般應(yīng)用于 ISHH探針的最佳長度應(yīng)在50～ 100個堿基之間。探針短易進入細胞，雜交率高，雜交時間短。 3．把握雜交的溫度和時間：雜交的溫度也是雜交成功與否的一個重要環(huán)節(jié)。根據(jù)探針的種類不同，溫度略有差異， RNA和 cRNA探針一般在 37～ 42℃ 左右，而 DNA探針或細胞內(nèi)靶核苷酸為 DNA的，則必須在 80～ 95℃ 加熱使其變性。 （四）雜交后處理（ post hybridisation treatment） 雜交后處理包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。在原位雜交組織化學(xué)的實驗程序中，這也是一個重要的環(huán)節(jié) 。 通過雜交后的洗滌可有效地減低背景染色，獲得較好的反差效果。 洗滌的條件如鹽溶液的濃度、溫度、洗滌次數(shù)和時間因核酸探針的類型和標記的種類不同而有差異。 （五）顯示（ Visualization） 顯示又可稱為檢測系統(tǒng)（ Detection system）。根據(jù)核酸探針標記物的種類分別進行放射自顯影或利用酶檢測系統(tǒng)進行不同顯色處理 ISHH的最大優(yōu)點是它的高度特異性，它可測定組織、培養(yǎng)的單個細胞或細胞提取物中的核苷酸含量。 組織原位雜交 熒光原位雜交 抗微管蛋白免疫染色法顯示培養(yǎng)細胞微管 激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)及 其在細胞生物學(xué)中的應(yīng)用 激光掃描共聚焦顯微鏡是近二十年發(fā)展起來的醫(yī)學(xué)圖象分析儀器，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于熒光定量測量、共焦圖象分析、三維圖象重建、活細胞動力學(xué)參數(shù)監(jiān)測和胞間通訊