【正文】 作用后反射、折射、衍射等綜合的結(jié)果，它能反映細胞群體及其不同亞群形態(tài)學的一些信息，并且不依賴細胞樣品的熒光染色過程。熒光信號主要是指經(jīng)過特異熒光染色后細胞受照發(fā)射的熒光信號。各種特異熒光染色方法是針對細胞內(nèi)各種不同的生化成分或各種特異抗原等設(shè)計的。每一種熒光染色方法中必須用到一種或多種的熒光染料。由于每一種熒光分子結(jié)構(gòu)不同，考慮熒光激發(fā)譜與熒光發(fā)射譜的接受時，通常要注意選擇合適的激發(fā)光源和各類分束濾色片。流式細胞術(shù)為了保證獲得準確的測試分析結(jié)果必須進行必要的質(zhì)量控制，選用標準熒光微球和固定的雞血細胞是最常用的儀器參考標準。（二）流式細胞術(shù)樣品制備流式細胞術(shù)要做高精度的單細胞定量分析，對細胞樣品的制備技術(shù)有著特殊的要求。一般包括單細胞懸液的制備和細胞熒光染色。1．單細胞懸液的制備 流式細胞術(shù)的分析檢測建立在單個細胞的基礎(chǔ)上，制備合格的單個分散的細胞懸液是非常關(guān)鍵的一環(huán)。對不同來源和不同形式的樣品，根據(jù)各種樣品的特點可選擇不同的分散方法。（1） 單層培養(yǎng)細胞、血液、各種脫落細胞等樣品，標本經(jīng)過簡單的制備懸液，離心分離處理，就可以得到分散較好的單個細胞懸液，是理想的流式細胞術(shù)檢測對象。（2） 對于不同組織來源的實體組織標本，采用酶消化法、機械法和化學試劑處理法來分散細胞。（3） 石臘包埋組織單細胞懸液的制備，可使大量存檔的臨床資料重新得到研究與利用，從而擴大了流式細胞術(shù)的應用范圍。樣品制備一般通過切片、脫脂、水化、消化及終止消化后過濾再收集細胞懸液，去除碎片的單細胞懸液用70%酒精固定保存。流式細胞術(shù)所測的細胞樣品要求細胞呈單個分散狀態(tài)，其中細胞團塊，細胞碎片盡可能少，分散過程中細胞的活性不受到明顯的損害，以保證下一步的熒光染色處理。所以在實際應用時，一個理想的單個細胞分散的細胞懸液樣品的制備往往是兩種或多種方法的結(jié)合使用，才能獲得理想的細胞懸液。2. 細胞的熒光染色流式細胞術(shù)快速分析單細胞的各種生物學特性和各種生化成份并定量測定這些參數(shù)是通過熒光細胞化學方法實現(xiàn)的。與光鏡下或電鏡下的細胞化學方法一樣，對細胞內(nèi)的每一種生化成份都可以找到其特異的熒光細胞化學染色方法。由于流式細胞術(shù)所需求的熒光細胞化學過程必須在細胞懸液中進行，因而又有其特點。細胞熒光染色必須選擇適當?shù)臒晒馓结?。熒光細胞化學過程要求有足夠的特異性，即所用熒光染料與所感興趣的細胞成份是否為特異性結(jié)合，嚴格控制各種反應條件是保證反應特異性的重要因素。染料的熒光光譜和量子產(chǎn)率是受環(huán)境因素影響的，在相同的條件下，熒光反應產(chǎn)物的產(chǎn)率（熒光強度）與所研究的生化成份的含量或活性之間有嚴格的化學定量關(guān)系，因此足夠的特異性和可靠的定量關(guān)系是熒光細胞化學過程的兩個基本評價標準。現(xiàn)在熒光探針已有幾千種，正確選擇熒光探針是首要工作。常用熒光探針有細胞活性探針，有活細胞熒光探針和死細胞探針之分；膜熒光探針主要用于生物膜以及脂質(zhì)轉(zhuǎn)運和代謝動力學研究，較多地用于膜融合和脂質(zhì)轉(zhuǎn)移的觀察；離子膜探針有陰離子型膜探針，大多數(shù)探針熒光基團標記在脂肪酸的烷基上，陽離子型膜探針較易定位在胞膜，可檢測膜表面積和細胞體積的改變，中性膜探針包括非極性和兩性探針，有可能對膜有特異的親和力；細胞器探針能夠滲透到細胞內(nèi)，選擇性地與細胞中的細胞器結(jié)合的熒光物質(zhì)，實質(zhì)上就是熒光染料；位點特異性探針是指可選擇性地與生物大分子相結(jié)合或進入細胞內(nèi)與某些特異位點相結(jié)合，來研究細胞內(nèi)外結(jié)構(gòu)及其活性的探針；胞內(nèi)離子探針利用熒光檢測細胞內(nèi)各類離子濃度，包括Ca2+、Mg2+、Na+、和H+ 等，其它還有可溶性熒光探針、核酸熒光探針、電位敏感性熒光探針、底物熒光探針和籠鎖化合物熒光探針等。目前，流式細胞術(shù)廣泛應用于細胞含量測定、核型分析、細胞凋亡檢測、細胞免疫表型分析、細胞因子檢測和細胞分選等方面，應用范圍在不斷地擴大。二、顯微分光光度術(shù)顯微分光光度術(shù)（microspectrophotometry， MSP）實質(zhì)上是顯微鏡技術(shù)和分光光度技術(shù)的結(jié)合。它以物質(zhì)分子的光吸收、熒光發(fā)射和光反射特性作為測量基礎(chǔ)，可以對細胞內(nèi)的某些重要的生物分子（如DNA、RNA、蛋白質(zhì)等）的含量進行定量測試，是組織化學和細胞生物學中定量研究的必不可少的工具。顯微分光光度計由主控計算機、多功能顯微鏡、透射和落射光源、單色儀、高精度掃描臺和光電倍增管等構(gòu)成。常用測量方法有顯微熒光光度術(shù)（Microfluorometry）、顯微密度術(shù)（Microdensitometry）、細胞光度術(shù)（Cytophotometry）顯微反射光度測量及波長掃描測量等。與通常的生化定量方法相比，用顯微光度術(shù)測定物質(zhì)含量的主要優(yōu)點是所用材料少，在同一涂片上測得多個參數(shù)；結(jié)合形態(tài)學特點，可選擇測定單個細胞或細胞器內(nèi)的多種物質(zhì)及細胞的代謝產(chǎn)物，同時可將測量光欄定位于細胞的某一部位或細胞器中；整個測量不需復雜的純化過程，能在短時內(nèi)測得結(jié)果，便于觀察藥物作用對細胞活性改變的影響（一） 顯微吸收光度術(shù)測量 顯微吸收光度法時一種光度測量的化學方法，它基于細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、多糖、核酸、脂類和酶染顆粒能在不同等電點下電離出不同側(cè)基，因而造成對染料親和力不同，應用不同的化學試劑染色，可使不同的細胞組分染上不同的顏色，在顯微鏡下成為可見的結(jié)構(gòu)。染料于組分的結(jié)合必須是特異性的，即染料、細胞組分結(jié)合物的光吸收是遵循朗伯比爾定律，而且染色深淺與被染細胞組分之間呈化學劑量學關(guān)系，符合這兩者關(guān)系的樣本就可應用吸收測量法，通過光檢測器（可使光能變成電能）測量有色化合物吸收單色光的量。 當光束通過固體液體或氣體介質(zhì)時，常有部分光被吸收轉(zhuǎn)換成其他形式的能量。物質(zhì)的光吸收和光波長有關(guān)，其吸收能力可通過測定入射光經(jīng)測量區(qū)域的前后光強度換算出光密度來定量分析，它的吸收特性必須遵循朗伯比爾（LambertBeer）定律。朗伯比爾定律規(guī)定，當單色的平行光通過均勻溶液時，溶液的吸收能力和溶液的路程長度及溶質(zhì)濃度成正比?？赏ㄟ^消光度A來確定。 A=lgT=lgIo/I=KCL式中T為溶液透光率，Io和I分別為入射光強和透射光強，K為吸收常數(shù)，C為吸光溶質(zhì)濃度，L為光程。由于光強度比較容易測量，經(jīng)單色儀或干涉濾光片能得到單色光，顯微鏡近軸區(qū)的照射光近似于平行光，所以凡在涂片切片中含有吸光特性的物質(zhì),理論上均可采用吸收光度法測量。動植物中許多天然有色物質(zhì)如肌紅蛋白、血紅蛋白、細胞色素c等，可用吸收光度法測含量；組織化學法染色的完整細胞的涂片如DNA的福爾根染色，可用該方法測量胞核DNA相對含量；還可用該法進行各類酶標的定量測量，對蛋白質(zhì)進行干擾校正后在天然吸收基礎(chǔ)上測定核酸含量。 顯微吸收光度測量需滿足朗伯比爾定律條件，待測物質(zhì)需為均質(zhì)，但生物學物質(zhì)很少是均質(zhì)的，而且顯微鏡成像過程中，經(jīng)過光路系統(tǒng)各界面多次折射反射后會導致測量中的分布誤差、閃爍誤差、系統(tǒng)誤差等，影響測量精度。所以除校正系統(tǒng)至最佳狀態(tài)外，常用雙波長法、一波二區(qū)法和掃描法來消除誤差。掃描法是最令人滿意的方法。測量時，先將待測物分成大量小區(qū)域，近似認為每個小區(qū)域內(nèi)物質(zhì)分布為均質(zhì)，采用順序逐點掃描法測出各小區(qū)域的消光度，經(jīng)積分后換算出待測物的總消光度，求得其相對含量。掃描法根據(jù)不同掃描方式可分為：飛點掃描、像掃描、物掃描、TV掃描等。在實際測量時，臺物掃描是最常用的方法，在高精度掃描臺上放好樣品，確定其掃描范圍和波長，根據(jù)放大倍數(shù)確定測量光欄的大小，根據(jù)待測物確定單色入射光波長，選取全自動掃描后由計算機數(shù)據(jù)處理并顯示結(jié)果及掃描圖形。臺物在x方向和y方向上來回移動，而測量光欄位置不動，使臺上的被測物質(zhì)各小區(qū)域依序進入測量光欄內(nèi)而被測量；也可用影象掃描，臺物不動，測量光欄的象在臺物上沿x方向和y方向來回移動，掃描測量重復性好，準確性和靈敏度高，測量精度可達109g，可方便地進行細胞內(nèi)細微結(jié)構(gòu)的分析，區(qū)分不同細胞類型的差別。 （二）顯微熒光光度測量定量顯微熒光光度測量是組織化學和細胞化學中的另一種重要技術(shù)，可通過測試固定組織細胞內(nèi)的熒光反應物來對生物學標本進行定量分析。熒光種類有物質(zhì)的自發(fā)熒光或是用熒光染料對某些生物學物質(zhì)作特選染色后產(chǎn)生的繼光熒光。與吸收光度測量相比，顯微熒光光度測量有許多明顯的優(yōu)點。一般熒光測量所用染料濃度遠比吸收法低，甚至可低10000倍，尤其在背景足夠暗時可對低濃度熒光物質(zhì)高度敏感，可測量細胞內(nèi)分散的微小顆粒。熒光物質(zhì)本身是自發(fā)光體，無論測量孔徑內(nèi)物體形狀規(guī)則與否，物質(zhì)分布均勻與否，物體輻射的光量子在光電倍增管上都產(chǎn)生同樣的效應，所以無需掃描測量就可避免分布誤差。通過選取適當?shù)募ぐl(fā)波長和發(fā)射波長的譜線和寬度，可以做到高特異性的測量，通常顯微分光光度計選用適當?shù)恼瓗V色片來獲取所需熒光波長，高精度的顯微分光光度計采用光柵單色儀，可獲得5nm帶寬的激發(fā)波長和檢測波長。熒光光度熒光測量方法分有堵塞法和掃描光度法，測量多數(shù)采用堵塞法，選取足夠大的測量光欄對待測物作總體熒光量測定，樣品由計算機定位，可快速測量，適于大樣本分析。熒光光度測量缺點是：熒光易衰減，有漂白作用，有時會猝滅，還必須減去本底熒光值。因此測量時要提高信噪比，必須掌握適當?shù)募ぐl(fā)時間和合適的熒光標準。三、圖像分析系統(tǒng) 圖像分析（image analysis，IA）是分析細胞學中主要測量手段之一，常用于細胞形態(tài)分析、腫瘤細胞分析、染色體核型分析等方面，借助于顯微分光光度技術(shù)，還可定量測試細胞內(nèi)DNA，RNA含量和分布，隨著圖像分析處理技術(shù)的進展，圖像分析處理的方法也由靜態(tài)到動態(tài)，由平面到三維立體，由單色到真彩色而不斷進展，它在生物醫(yī)學應用領(lǐng)域中的作用將越來越重要。 圖像分析處理通常是指計算機數(shù)字圖像處理(image processing，IP) ，為了便于用計算機處理，必須把圖像作為二進制數(shù)值來表示。普通光學系統(tǒng)和電視攝像等成像設(shè)備得到的是模擬圖像，圖像在二維平面上位置和強度的分布是連續(xù)的，要得到數(shù)字圖像，必須對模擬圖像進行空間點陣上的抽樣和顏色灰度的量化的數(shù)字化操作，得到以像素為基本單位的數(shù)字矩陣，每個像素的顏色由灰度值表示，通常量化成8比特(bit)，即256個灰度等級。所謂數(shù)字圖像就是灰度值的二維數(shù)組圖像，如用函數(shù)F(x，y)表示數(shù)字圖象，F(xiàn)(i，j)除了代表圖像中位于i，j處的像素的同時，還表示該像素的灰度值的大小。數(shù)字圖像一般采用正多邊形點陣，最常用的是正方形點陣，如圖211所示。圖像數(shù)字化的精度對圖像質(zhì)量會有很大的影響，像素越多，圖像分辨率越高，灰度等級越高，圖像層次越豐富，清晰度高。數(shù)字圖像運算建立在數(shù)字矩陣基礎(chǔ)上，有許多基本處理功能和算法形式，與模擬圖像比較具有精度高，通用性強，再現(xiàn)性和靈活性好等優(yōu)點。 圖2－11 數(shù)字圖像示意圖 參照前書圖29 圖像分析系統(tǒng)一般由計算機，圖像輸入設(shè)備，圖像輸出設(shè)備和交互控制設(shè)備構(gòu)成。計算機系統(tǒng)，要求運算速度快，內(nèi)存大，圖像陣列處理器和顯示卡的內(nèi)存也應盡可能大，配備大容量存貯器便于圖像備份。圖像輸入設(shè)備常用的有高解像度的攝像機、CCD攝像機、掃描儀和數(shù)碼像機等。圖像輸出設(shè)備有視頻打印機，激光打印機，圖像硬拷貝機等。交互控制設(shè)備有鼠標和數(shù)字化圖形輸入板，可以用人機對話的方式選取工作菜單，執(zhí)行指令，還可控制圖形的輸入和處理。 圖像分析系統(tǒng)的核心部分是圖像分析處理軟件，分為通用軟件和專用軟件，它直接決定了分析結(jié)果的優(yōu)劣。 醫(yī)學圖像成像方式多種多樣，來自不同途徑的圖像不可避免地存在著噪聲和畸變，為了得到較好的圖像分析處理結(jié)果，提取我們感興趣的圖像細節(jié)，首先必須進行圖像增強(image enhancement) ，在成像過程中 原圖中總存在各種噪聲和畸變，為使像質(zhì)得到改善以利于特征提取和圖像識別，對圖像進行預處理，目的是圖像增強也叫圖像質(zhì)量改善。圖像增強的方法很多，對比度增強可通過灰度變換，直方圖均衡等方式提高圖像的對比度和清晰度。陰影校正和圖像多幀數(shù)學運算可消除成像系統(tǒng)形成的照明場誤差，改善圖像的陰影，畸變和明暗差，突出感興趣的圖像特征。銳化處理通過微分法或梯度法等高頻濾波算法可消除圖像的模糊，增強圖像高頻成分，使圖像輪廓分明。平滑處理常用局部平均法，中值濾波法有效地去除圖像中高頻噪聲。 為了根據(jù)圖像的結(jié)構(gòu)特征，分離出感興趣的對象物，以便進行圖像識別和分析，圖像分割(image segmentation)是選取灰度閾值，區(qū)分主要對象、其他對象和背景的主要手段。圖像分割通常用二值化閾值處理，根據(jù)圖像的灰度直方圖確定對象物的閾值，使對像物和背景以0和1分別顯示，便于計算機處理，也可進行多相分割，通過灰度直方圖中多個峰值加以區(qū)分，分別定出閾值，根據(jù)灰度閾值范圍分割出各類對象物。 圖像二值化處理(image binary) 通過各種矩陣算子對二值圖進行腐蝕膨脹，開放封閉，填空洞，擦碎片，骨骼細化等形態(tài)學方法處理，也可采用布爾代數(shù)方法，進行邏輯運算，從而整理圖像畫面，清除不感興趣的對象，便