【正文】 瓶中。（4）去上清夜：將上層細(xì)胞懸液靜置30分鐘左右，即可見細(xì)胞沉淀，用吸管輕輕吸去上清夜，(5)標(biāo)本制備:在一張經(jīng)過充分洗凈脫脂,并預(yù)先在蒸餾水中冷凍的清潔載玻片上,用吸管滴23滴細(xì)胞懸液,立即將載玻片一端抬起,并輕輕吹氣，使細(xì)胞迅速分散，然后在酒精燈火焰上微微加熱烤干。（6）染色：同涂片法（4）在顯微鏡下尋找典型的中期染色體，注意觀察中期染色體的長臂、短臂和著絲粒位置，并盡可能找到具隨體染色體。實(shí)驗(yàn)步驟流程如下：取材預(yù)處理前低滲 固定 沖洗 酶解去壁 酶解去壁后低滲涂片法 懸液法制備細(xì)胞懸液 固定 固定 去沉淀 涂片 細(xì)胞懸液 去上清 火焰干燥 火焰干燥制片 Giemsa染色 Giemsa染色 沖洗 沖洗 空氣干燥 空氣干燥 鏡檢 鏡檢六、注意事項(xiàng)：預(yù)處理是很重要的一個(gè)步驟，必要時(shí)可將預(yù)處理藥品直接加到培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行活體處理3—4小時(shí)，以便獲得更多的中期分裂相。七、作業(yè)：中期染色體具有哪些形態(tài)特征？繪制一完整細(xì)胞并帶有隨體的中期染色體圖實(shí)驗(yàn)十四、細(xì)胞凋亡一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆莸蛲黾?xì)胞的形態(tài)特征學(xué)會(huì)用熒光探針對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙標(biāo)記來檢測正常活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的方法二、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞死亡根據(jù)其性質(zhì)、起源及生物學(xué)意義區(qū)分為凋亡和壞死兩種不同類型。凋亡普遍存在于生命界，在生物個(gè)體和生存中起著非常重要的作用。它是細(xì)胞在一定生理?xiàng)l件下一系列順序發(fā)生事件的組合，是細(xì)胞遵循一定規(guī)律自己結(jié)束生命的自主控制過程。細(xì)胞凋亡具有可鑒別的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征。在形態(tài)上可見凋亡細(xì)胞與周圍細(xì)胞脫離接觸，細(xì)胞變園，細(xì)胞膜向內(nèi)皺縮、胞漿濃縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、細(xì)胞核固縮破裂呈團(tuán)塊狀或新月狀分布、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞膜進(jìn)一步融合將細(xì)胞分成多個(gè)完整包裹的凋亡小體，凋亡小體最后被吞噬細(xì)胞吞噬消化。在凋亡過程中細(xì)胞內(nèi)容物并不釋放到細(xì)胞外，不會(huì)影響其它細(xì)胞，因而不引起炎癥反應(yīng)。在生物化學(xué)上，多數(shù)細(xì)胞凋亡的過程中，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶活化，活性增加。核DNA隨機(jī)地在核小體的連接部位被酶切斷，降解為180200bp或它的整倍數(shù)的各種片斷。如果對(duì)核DNA進(jìn)行瓊脂糖電泳，可顯示以180200bp為基數(shù)的DNA ladder（梯狀帶紋）的特征。相比之下，壞死是細(xì)胞處于劇烈損傷條件下發(fā)生的細(xì)胞死亡。細(xì)胞在壞死早期即喪失質(zhì)膜完整性，各種細(xì)胞器膨脹，進(jìn)而質(zhì)膜崩解釋放出其中的內(nèi)容物，引起炎癥反應(yīng)，壞死過程中細(xì)胞核DNA雖也降解，但由于存在各種長度不等的DNA片斷，不能形成梯狀帶紋，而呈彌散狀。一些溫和的損傷刺激及一些抗腫瘤藥物可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，通常這些因素在誘導(dǎo)凋亡的同時(shí)，也可產(chǎn)生細(xì)胞壞死，這取決于損傷的劇烈程度和細(xì)胞本身對(duì)刺激的敏感程度。三尖杉酯堿（HT）是我國自行研制的一種對(duì)急性粒細(xì)胞白血病，急性單核白血病等有良好療效的抗腫瘤藥物。~5μg/ml范圍內(nèi)作用2小時(shí)，即可誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡，并表現(xiàn)出典型的凋亡特征。本實(shí)驗(yàn)用1μg/ml HT在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的HL60細(xì)胞發(fā)生凋亡，同時(shí)，也有少數(shù)細(xì)胞發(fā)生壞死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙重染色，可以區(qū)別凋亡、壞死及正常細(xì)胞。細(xì)胞膜是一選擇性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿過質(zhì)膜。當(dāng)細(xì)胞壞死時(shí)，質(zhì)膜不完整，PI就進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，它可嵌入到DNA或RNA中，使壞死細(xì)胞著色，凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞不著色。而一些活細(xì)胞染料由于為親脂性物質(zhì)，可跨膜進(jìn)入活細(xì)胞，因而可進(jìn)行活細(xì)胞染色。Hoechst33342是一種活性熒光染料且毒性較弱，它是雙苯并咪唑的一種衍生物。與DNA特異結(jié)合（主要結(jié)合于AT）堿基區(qū)），顯示凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞。凡是看到有凋亡小體的細(xì)胞都是凋亡細(xì)胞。三、實(shí)驗(yàn)用品：試劑：三尖杉酯堿（HT），300μg/ml，100mmol/L TrisHCl（），5mol/L EDTA緩沖液、堿性裂解液：, 1%SDS、醋酸鈉：3mol/L KAc（）；異丙醇；70%乙醇；溴酚藍(lán)，蔗糖指示劑。TBE電泳緩沖液，1%瓊脂糖，溴乙錠。PI母液：500μg/ml；Ho33342母液：2mmol/L。儀器設(shè)備：熒光顯微鏡，電泳儀，電泳槽，微量加樣器（1ml，100μl）、載玻片，蓋玻片。四、實(shí)驗(yàn)材料：人早幼粒白血病HL60細(xì)胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。五、方法步驟：三尖杉酯堿誘發(fā)HL60細(xì)胞凋亡（1）實(shí)驗(yàn)前約24小時(shí)，接種兩瓶HL60細(xì)胞，標(biāo)記①、②，每瓶含約6ml培養(yǎng)液，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。（2），當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%，①號(hào)瓶加入三尖杉酯堿200μl，使終濃度為1μg/ml，②號(hào)瓶中加入同等量PBS（）作對(duì)照。Ho33342和PI雙重染色鑒別三種細(xì)胞（1）染色：將瓶中的細(xì)胞搖勻，加入Ho33342母液2μl，PI 20μl，染色15分鐘。（2）滴片：取一載玻片，用雙面膠圍成一小室，從離心管中各取以上染色后的細(xì)胞懸液10μl，加入小室內(nèi)蓋上蓋玻片，熒光鏡下用紫外激發(fā)光，高倍鏡下觀察，區(qū)別三種細(xì)胞，并注意三者比例。六、注意事項(xiàng)：誘導(dǎo)培養(yǎng)HL60細(xì)胞時(shí)間要準(zhǔn)確。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞時(shí)，由于熒光易碎滅，觀察時(shí)要盡量快。七、作業(yè)：總結(jié)細(xì)胞凋亡形態(tài)特征。 根據(jù)你的觀察，填下表，細(xì)胞形態(tài)一欄要求畫出你所觀察到的典型細(xì)胞圖象正常細(xì)胞凋亡細(xì)胞壞死細(xì)胞熒光顏色細(xì)胞形態(tài)所占百分比實(shí)驗(yàn)十五、透射及掃描電鏡演示實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私馔干潆婄R、掃描電鏡各部件的名稱、結(jié)構(gòu)及性能；了解透射及掃描電鏡的基本操作程序；了解電鏡樣品制備的配套設(shè)備。二、實(shí)驗(yàn)儀器及用品：透射電鏡；掃描電鏡；小白鼠肝臟超薄切片；酵母菌或乳酸桿菌的負(fù)染樣品；噴好金膜的葉片及花粉樣品三、方法步驟：（一）透射電鏡操作規(guī)程：本儀器的操作者必須熟悉儀器的全部操作規(guī)程，通過操作考試后才能正式上機(jī)操作。操作程序1）開機(jī)準(zhǔn)備（1） 合上總電源閘刀，開啟電子交流穩(wěn)壓器，電壓指示應(yīng)為220V。開啟循環(huán)水，溫度指示應(yīng)為1520℃。（2） 開啟主機(jī)真空開關(guān)。（3） 約20分鐘后，待高真空指示燈及照相室指示燈亮。2）工作程序（1）開啟主機(jī)電源開關(guān)，待熒光屏顯示操作數(shù)據(jù)后再進(jìn)行下一步。（2）逐級(jí)加高壓致所需電壓，每加一級(jí)高壓，必須等高壓表中指示針停止擺動(dòng)才能加下一級(jí)。如指示針移出量程，必須從最低移級(jí)加起。（4） 根據(jù)說明書要求進(jìn)行合軸操作，使儀器處于最佳操作狀態(tài)。（4）根據(jù)說明書的操作要求進(jìn)行觀察、換樣和拍照。（5）作好實(shí)驗(yàn)記錄及儀器使用記錄。3）關(guān)機(jī)程序（1）關(guān)燈絲電流。（2）關(guān)高壓。（3）關(guān)主機(jī)電源開關(guān)。（4）關(guān)真空開關(guān)。（5） 20分鐘后，關(guān)循環(huán)水和電子交流穩(wěn)壓器開關(guān)。（6） 關(guān)閉總電源。（二）掃描電鏡操作規(guī)程：本儀器的操作者必須熟悉儀器的全部操作規(guī)程，通過操作考試后才能正式上機(jī)操作。操作程序1）開機(jī)準(zhǔn)備（1）合上總電源閘刀，開啟電子交流穩(wěn)壓器，電壓指示應(yīng)為220V。開啟冷卻循環(huán)水裝置電源開關(guān)。（2）開啟試樣室真空開關(guān)（VACUUM POWER），開啟試樣室準(zhǔn)備狀態(tài)開頭（STAND BY）。（3）開啟控制柜電源開關(guān)（POWER）.（4）約20分鐘后，往試樣室液氮冷井中加入液氮。2）工作程序（1）開啟試樣室進(jìn)氣閥控制開關(guān)（CHAMB VENT），將試樣放入試樣室后將試樣室進(jìn)氣閥控制開關(guān)（CHAMB VENT）關(guān)閉抽真空。（2）開啟鏡筒真空隔閥。（3）加高壓（ACCELERATION POTENTIAL）至25KV.（4）加燈絲電流（FILAMENT）.（5）調(diào)節(jié)顯示器對(duì)比度（CONTRAST）、亮度（BRIGHTNESS）至適當(dāng)位置.（6）將圖象選區(qū)開關(guān)撥至全屏（FULL）.（7）調(diào)節(jié)聚焦旋鈕（MEDIUM）和(FINE)至圖象清晰。（8）選擇適當(dāng)?shù)膾呙杷俾剩⊿CAN RATE）觀察圖象。（9）根據(jù)說明書的操作要求進(jìn)行觀察和拍照。（10）作好實(shí)驗(yàn)記錄及儀器使用記錄。3）關(guān)機(jī)程序（1）關(guān)燈絲電流（FILAMENT）。（2）關(guān)高壓（ACCELERATION POTENTIAL）。（3）反時(shí)針調(diào)節(jié)顯示器對(duì)比度（CONTRAST）、亮度（BRIGHTNESS）到底.（4）關(guān)閉鏡筒真空隔閥。（5）關(guān)主機(jī)電源開關(guān)。（6）關(guān)真空開關(guān)。（7）20分鐘后，關(guān)循環(huán)水和電子交流穩(wěn)壓器開關(guān)。（8）關(guān)閉總電源。四、觀察結(jié)果：小白鼠肝臟超薄切片：一般可見細(xì)胞膜、核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、肌纖維等結(jié)構(gòu)。酵母菌或乳酸桿菌的負(fù)染樣品：由于重金屬鹽在樣品周圍的堆積而使樣品顯示負(fù)的反差，從而襯托出樣品的形態(tài)和大小。酵母菌近球型，有時(shí)可見出芽生殖；乳酸桿菌為桿狀。葉片在掃描電鏡下一般可見上表皮有各種紋飾，下表皮可見氣孔器形態(tài)花粉在掃描電鏡下一般可見表面的萌發(fā)溝和紋飾。觀察過程中尋找典型部位進(jìn)行拍照。五、作業(yè)：說明電子顯微鏡的成像原理及主要部件的名稱和作用 28 /