【正文】 短臂長度 按照Levan（1640）標準劃分，－，－，－， 。 ：指短臂占整個染色體長度的比率，他決定著絲粒的相對位置。 短臂長度 著絲粒指數(shù) ＝ —————————— 100 整條染色體的全長 按照Levan（1640）標準劃分，－，－，－，－。 ：是根據(jù)著絲粒位置耐確定的，著絲粒位于染色體端部，稱端著絲點染色體，其臂數(shù)可計算為一個，若著絲粒位于染色體中部或亞中部的，染色體臂數(shù)可計算為兩個。三。人類體細胞核型：人類細胞正常核型含有46條染色體，相互構(gòu)成23對，其中22對是男女說共有的，稱常染色體，一對為男女所不同的，稱性染色體。女性有兩條X染色體，男性有一條X染色體核一條Y染色體。根據(jù)丹佛（1960）、倫敦（1963）、和芝加哥（1966）會議提出的標準，即按染色體的長度依次減少和著絲粒的位置，以及其它特征把人體細胞的23對染色體分為7組：A組：包括13對染色體，中部著絲點、體積最大，易區(qū)別，第二對著絲點略偏離中心。B組：包括45對染色體，亞中部著絲點，體積較大，兩對不容易區(qū)分。C組：包括612對染色體，亞中部著絲點,中等大小，彼此之間不易區(qū)分，以下幾點有助于識別本組中的各對染色體，8號著絲粒靠近中央（短臂較長），12號短臂較短，X染色體大大小介于67號之間。女性細胞中有兩條X染色體，所以共有C組染色體16條（8對），男性則只有1條X染色體，所以C組染色體共有15條（7對半）。D組：包括1315對，近端著絲點，短臂較短，末端可能有隨體，彼此不易區(qū)分。E組：包括1618對，中等大小，16號有中部著絲點，長臂上有時又縊痕，118號都有亞中著絲點，后者的短臂較短。F組：包括1920對染色體，都有中著絲點，彼此之間不易區(qū)分。G組：包括2123對染色體，都有近端著絲點，短臂末端可能有隨體，長臂常呈二分叉狀。男性細胞的Y染色體也屬于G組，體積略大，短臂末端無隨體，鏈條染色單體長臂常常平行。四、器材準備：。、鑷子。、分規(guī)。五、操作方法：，一個細胞的全部染色體，一條一條剪下/，進行分組，并依次序排列。，逐條檢查形態(tài)特征與分類標準是否符合，確信無疑時，再用膠水粘貼整齊。六、試驗報告的主要內(nèi)容：，每組由那些基本特征？？。 實驗十一 線粒體的分離及活性測定線粒體是真核細胞的一個重要細胞器，好氧生物細胞需能的25%以上是靠有氧呼吸供給，而線粒體是細胞內(nèi)唯一有氧呼吸的場所，因此，人們就一細胞“動力站”之稱。線粒體結(jié)構(gòu)和功能上的研究至今一直是一個非?；钴S的領(lǐng)域，本試驗在于學(xué)會分離線粒體和測定線粒體活力，以高活力的線粒體制劑用于各種目的的研究。一、儀器與設(shè)備：，或萬轉(zhuǎn)/分離心機。，研缽、漏斗、紗布（尼龍布）、量筒、微量注射器、移液管、試管等。（氧極普測試系統(tǒng)）。、冰浴。二、材料與試劑：，但最好是生活力強，生長旺盛，幼嫩組織為好，如心肌、肝臟、骨骼肌、黃化幼苗、塊根、塊莖等。（，）緩沖液。（，）。：在1000ml溶液中含有甘露醇（）、牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA，1mg/ml），EDTA（），TriSHCl（，）緩沖液。（同試劑4，但不加BSA）。：在1000ml溶液中含有甘露醇（）、蔗糖（）、KCl（10ml，）、EDTA（）、MgCl2（5mM）、TriSHCl（10mM，）。：α—酮戊二酸 ，ADP 。三、線粒體的分離：線粒體在離體條件先很容易受各種因素（物理和化學(xué)的）作用而失活，特別是膜的完整性極為重要，因為只有完整的線粒體才能進行有氧呼吸。所以在分離操作中要掌握以下幾個要點：[1].整個過程要保持在低溫下（04 oC）進行。[2].要注意分離介質(zhì)的pH值，pH值應(yīng)和被采用的材料一致。[3].搗碎時間要控制得當(dāng)，或勻漿適度，爭取獲得更多的完整線粒體。[4].盡可能縮短分離時間，以確保被分離線粒體的質(zhì)量。不同材料，在分離線粒體的程序上不同，下面列舉兔肝，鼠肝細胞線粒體和馬鈴薯塊莖制備線粒體的分離程序。：將大或小鼠斷頭處死后，盡可能快地取出肝組織放入預(yù)冷的蔗糖分離液中，洗滌，稱重，以每克肝組織加8倍分離液，勻漿。詳細步驟如下圖：四、線粒體的形態(tài)鑒定 活線粒體鑒定：用懸浮液制的1％janus green B一滴，—1滴在載片上混合，靜止染色20分鐘后，在顯微鏡下檢查，線粒體衩染上蘭綠色，破了膜的線粒體不著色。 電鏡觀察：把分離線粒體在4％戊二醛中固定12小時，再用餓酸固定一小時，然后依次以30％—50％乙醇中各級脫水半小時，70％→80％→95％→100乙醇中脫水各半小時，以上在冰浴中進行，再在溫室下100％乙醇中脫水至干凈后，用環(huán)氧樹脂，Epon812或618包埋，超厚切片后，電鏡檢查。 線粒體腫脹檢查把分離線粒體在520nm下，測定光密度值（OD），腫脹線粒體數(shù)量高，OD值偏低。五、線粒體活力測定由于實驗?zāi)康牟煌?，有其相?yīng)指標來鑒別線粒體活性：呼吸控制率（RCR），氧化磷酸化效率和32Pi—ATP交換率可作為鑒定分離線粒體質(zhì)量指標。 呼吸控制北（RCR）和氧化磷酸化效率（P/O或ADP/O）測定。RCR是反映線粒體結(jié)構(gòu)的完整性及其功能的一個靈敏指標，RCR是指加入ADP刺激后的呼吸（呼吸態(tài)Ⅲ）和ADP消耗后的呼吸（呼吸態(tài)Ⅳ）之比，即RCR＝RⅢ/RⅣ，RCR值的大小，反映了線粒體氧化磷酸化的偶聯(lián)程度，離體的線粒體在測定呼吸時，不加底物下，也有微弱的耗氧，因此在氧電極記錄紙上有較低的斜率直線，這是由線粒體的內(nèi)源呼吸引起，所以稱為呼吸態(tài)Ⅰ，當(dāng)加入外源底物，α—酮戊二酸和β—氨基丁酸后，耗氧率迅速提高，此時下降的斜率稱謂呼吸態(tài)Ⅱ。當(dāng)加入ADP后呼吸耗氧率進一步升高，此時下降斜率稱為呼吸態(tài)Ⅲ，當(dāng)磷酸化底物耗盡后，線粒體耗氧北又降低，此時斜率為呼吸態(tài)Ⅳ，所以根據(jù)呼吸Ⅰ—Ⅳ改變即可以了解線粒體結(jié)構(gòu)完整性，電子傳遞及磷酸化偶聯(lián)狀態(tài)等。氧化磷酸化效率是指線粒體利用氧化釋放能量轉(zhuǎn)變換為ATP的效率，氧化磷酸化效率可用P/O或ADP/O來表示，P/O是指在某一氧化底物存在下，消耗一克原子氧時，有多少克原子的無機磷轉(zhuǎn)化為ATP。ADP/O指在同樣條件下，消耗1克原子氧，有多少克分子ADP轉(zhuǎn)化為ATP。按理論計算，α—酮戊二酸和β—氨基丁酸為底物時P/O或ADP/，將實測值和理論值相比，可檢查出分離線粒體的功能狀態(tài)。 32Pi—ATP交換活性測定這也是一個鑒別線粒體磷酸化偶聯(lián)活性指標，交換活性大，線粒體偶聯(lián)磷酸化活力高。即線粒體質(zhì)量較好，用未被交換32Pi和鉬酸銨反應(yīng)生成鉬酸銨，再用分步有機溶劑萃取法提取，被交換的磷形成ATP則分配于水相中，然后由水相抽樣，用定標器或液閃計數(shù)器測量其放射強度，再根據(jù)放射強度算出交換活性大小。六、測定RCR和ADP/O實例：不同來源的的線粒體，其反應(yīng)液系統(tǒng)駐條件下不同，這里以黃化玉米苗線粒體為例。，濕度25℃，氧極譜法。（25℃）的反應(yīng)液注入反應(yīng)室，打開攪拌器，待溫度恒定后，開啟記錄儀并調(diào)節(jié)靈敏度及零點，此時的記錄斜率較低直線，為呼吸態(tài)Ⅰ。待斜率穩(wěn)定后加入50ul底物α—酮戊二酸，此時的斜率為呼吸其質(zhì)存在時氧耗速率，稱呼吸態(tài)Ⅱ。 ADP，此時出現(xiàn)較大斜率，謂呼吸態(tài)Ⅲ。 ADP盡后線粒體耗氧速率自動降低，稱呼吸態(tài)Ⅳ，如果加ADP又回到呼吸態(tài)Ⅲ。反應(yīng)結(jié)果ADP/O值計算：氧化磷酸化結(jié)果按圖，計算如下：線粒體控制的氧：ADP 加入ADP量（uM）—— ＝ ———————— O 所消耗氧量所消耗氧量＝U/XXV2U：每毫升溶液含UMO2量，25℃為260u mol/L。V：反應(yīng)液總體積為2ml。X：為2ml反應(yīng)液所含的溶解氧，相當(dāng)于記錄紙上幅度（80）Y：為R1Ⅱ格數(shù)（30格）Z：為由微克分子氧轉(zhuǎn)變?yōu)槲⒖嗽訒r系數(shù)。所以耗氧量＝303022=則ADP/O—＝（或P/O＝），RCR＝RⅢ/RⅣ=30格/14格＝ 注意事項：（1）制備植物線粒體隨組織破碎，伴隨線粒體易膨脹，及內(nèi)源脂肪酸，酚類物物質(zhì)可抵制線粒體正?；盍Γ灾苽鋾r注意使用甘露醇，蔗糖維持一定滲透壓力，加合劑和化合物可降低和去除酚類毒害作用，牛血清白蛋白（BSA）可以抵抗，降低脂肪酸或其它脂類毒害作用。（2）線粒體活力，也可以用Warburg計測定，這樣可以同時做幾個材料實驗。實驗報告： 分析實驗過程中所出現(xiàn)每一現(xiàn)象。 寫出實驗測出的線粒體活力，試分析原因。實驗十二 聯(lián)會復(fù)合體的染色與觀察1977年Moses證明光鏡可以檢查聯(lián)會復(fù)合體，其后發(fā)展了許多用于明視野顯微鏡觀察的方法，依靠光鏡顯示聯(lián)會復(fù)合體，不僅對SC的構(gòu)造、功能的研究有用，而且在臨床細胞遺傳學(xué)中對研究染色體異?，F(xiàn)象也是有用的，它大大加快了SC的研究特別是X、Y染色體配對行為的研究，并導(dǎo)致了X染色體上一種特殊發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的表現(xiàn)。一、 實驗?zāi)康模?觀察光鏡下聯(lián)會復(fù)合體的形態(tài)。二、 實驗原理：聯(lián)會復(fù)合體是指在減數(shù)分裂前期，同源染色體的配對行為所形成的一種特殊結(jié)構(gòu)，由側(cè)線、橫線和中央軸三部分組成，在前期的粗線期結(jié)構(gòu)較典型，它是動植物同源染色體聯(lián)會時相當(dāng)普遍的一種結(jié)構(gòu)。三、 試劑和器材實驗材料： 小白鼠（雄）器 材： 離心機、顯微鏡、水?。?5℃）、培養(yǎng)皿（直徑16cm）、鑷子、剪刀、吸管、燒杯、 量筒、離心管（10ml）、酒精燈、刻度吸管、鏡油、擦鏡紙、載玻片、臺秤。試 劑：① ％檸檬酸鈉溶液。② 3％中性福爾馬林溶液；。③ 50％硝酸銀溶液④ ％明膠；稱取2克明膠粉末，溶解于99ml蒸餾水中，加1ml甲酸。⑤ 甲醇、冰醋酸。四、 實驗方法 脫頸處死動物，取出睪丸，放入盛有1ml ％檸檬酸鈉培養(yǎng)器中。 分離并剪碎精小管，用吸管輕輕吹打，使精小管內(nèi)容物釋放出。 移至刻度離心管中，加4ml ％檸檬酸鈉溶液制成細胞懸浮液，室溫下低滲45—60分鐘。 在低滲終止前10分鐘，加3％，％混勻。 常規(guī)離心（1000rpm，10分鐘），棄去上清液。 加入甲醇和水醋酸（3：1）混合液（臨時用配制）5ml，固定10分鐘。 以10000rpm離心5分鐘，棄去上清液。 重復(fù)6—7步一次。 加入1ml新鮮固定液，混勻。 吸取細胞懸浮液，滴2—3滴于濕冷的載玻片上，置酒精燈上略加燒烤。1 銀染：加4滴50％AgNO3和2滴明膠天載玻片細胞面上，混勻，覆以擦鏡紙，置酒精燈上燒烤，至玻片標本呈褐黑色為止。1 以流水沖，去擦鏡紙，晾干。1 鏡檢。五、 實驗報告： 做好實驗記錄。 繪制聯(lián)會復(fù)合體形態(tài)草圖。實驗十三 細胞融合一、實驗?zāi)康模簝蓚€以上的細胞合并成為一個雙核或多核細胞稱為融合細胞。人工細胞融合開始于五十年代。六十年代到七十年代作為一門新興的技術(shù)發(fā)展很快，應(yīng)用范圍極廣，不僅名類細胞可以全并，種間遠緣細胞也能合并，細胞與組織不同，不排斥異類、異種細胞。動物細胞如此。因此融合細胞的研究成為生物學(xué)不論在基礎(chǔ)理論上或生產(chǎn)實踐上開辟了一條新的道路，如目前在核質(zhì)關(guān)系，體細胞的遺傳與發(fā)育，新品種的培養(yǎng)，免疫作用，疾病的治療和性狀的改良。潛伏病毒的研究等方面上，有的已取得了顯著的成績，有的正在探索之中。通過實驗對體細胞融合有一個清楚概念。并初步掌握動物細胞合并技術(shù)。二、材料和方法（1）取艾氏腹水瘤細胞。用注射器剌入接種瘤細胞7—10天的小白鼠腹腔內(nèi)吸取1或2ml腹水，注放離心管內(nèi)；加改良的Hank’s液（）（缺葡萄糖的Hank’s液，Okaba，1962）以800rpm（轉(zhuǎn)速）離心5分鐘，取出上清液，再入改良Hank’s液，攪拌，再同樣清洗兩次，一次5分鐘，一次十分鐘，最后再加上適量Hank’s液。計算每亳升的細胞數(shù)量，如與其它細胞合并用，適宜數(shù)目一般為107個/ml，即毫升約1000萬個細胞。（2）取雞血球，在一只公雞的翼靜脈抽取，抽取數(shù)量隨需要而定，如取5毫升，可用20毫升針筒，先將針與筒用Alsver液潤濕，吸入50毫升Alsver液剌入翼下靜脈，吸取5毫升液，注入15毫升Alsver液瓶內(nèi)，使血液與Alsver液的比例為1：4。存入4℃冰箱內(nèi)務(wù)作一星期使用。作實驗時取這種貯備的雞血球1毫升加入4毫升0。85%生理鹽水以1200—1500rpm離心三次（5分鐘、5分鐘、10分鐘），每次離心后去上清液，加0。85%生理鹽水并攪勻，最末一次離心后，根據(jù)沉淀血球量的多少，加入適量0。85%生理鹽水使成1%懸液（0。1毫升血球加10毫升液體），取1%懸液1毫升加上2毫升或3毫升0。85%生理鹽水或改良Hank’s液，使每一毫升含有血球1500萬左右。（3）病毒的培養(yǎng)和處理動物細胞的人工合并可用病毒作為介導(dǎo)物，有很多種類病毒能使細胞合并，如皰疹病毒，牛痘病毒，粘液病毒，新域病毒，副流感病毒，仙臺病毒等。其中以新域病毒和仙臺病毒為最佳，特別是Sendai virus,因為在雞胚中培養(yǎng)容易繁殖，我們就是用Sendai virus作細胞合并的介導(dǎo)物。Sendai virus是培養(yǎng)在孵化9—10天的雞胚線毛尿囊腔的內(nèi)胚層細胞中繁殖，作為種子用的病毒和作為細胞合并的病毒，在培養(yǎng)處理上有所不同，因后者用作實驗，所以需要量也大。接種到雞胚去的病毒，如不沖淡，會產(chǎn)生不完整的病毒顆粒。要得到完整的病毒顆粒，須把病毒沖淡約108到106倍注入量為0。2ml。這是在尿囊液中培養(yǎng)的標準量，為了避免遺傳變性，每五次后改用108到109量一次，接種后雞蛋仍孵化在37℃小時取出，放在20℃，40分鐘或4℃過液，使血液凝結(jié)。防止取尿囊液時出血，于是把尿囊液吸出，將每只雞的尿囊液注入一個試管，每管取少許尿囊液，分別培養(yǎng)，檢查有無細胞，并測定血凝效價（HAU），選無菌，效價高的，用無水丙酮快速冰結(jié)，保藏作為種子，務(wù)下次培養(yǎng)用。吸出尿囊液后，為了消滅病毒感染力，采用紫外光照射。將2毫升病毒懸浮液放入9厘米培養(yǎng)皿內(nèi)，置于紫外光下，淘汰與培養(yǎng)皿距離為30厘米，10分鐘，每融2分鐘搖動一次，燈光的強度約為20003000爾格/厘米/秒。經(jīng)過這樣處理的病毒，其感染力或活動力減少1006倍，但血凝效價和合并細胞能力沒有變化（Harris,1976）。取一份Ehrich腹水瘤細胞（107/ml）同一份雞血球懸液1500萬/ml混勻。隨即加入兩份滅活病毒尿囊液。在4℃冰水中，不時催動10分鐘，使細胞凝集。然后置放3745℃溫浴中1530分鐘完成融合過程，鏡檢計數(shù)。三、細胞融合的觀察（1）細胞在4℃中凝集，細胞的合并在病毒的參與下進行的，每一細胞要有足夠數(shù)量的病毒顆粒附在細胞臘上，細胞才能集合成堆，請注意當(dāng)腹水瘤細胞與雞血球1：1混合加2份Sendai virus病毒，在