【正文】 e spectroscope）或能譜儀（energy disapersive spectroscope）的電子顯微鏡。掃描電鏡的光源部分與透射電鏡相同，是由電子槍產(chǎn)生電子射線經(jīng)聚光鏡聚焦形成一束極細(xì)的光斑稱為電子探針（electron probe）。圖像的保留可通過熒光屏下的底片室內(nèi)的膠片感光，使圖像拍攝下來，也可將圖片通過探頭輸送到計算機中經(jīng)打印機打出圖片。成像系統(tǒng)由樣品室、物鏡、中間鏡和投影鏡組成，是電鏡具有高放大倍率和高分辨率的關(guān)鍵部位，主要是借助改變各個透鏡的電流來獲得不同的放大倍率。鏡體系統(tǒng)是電鏡的主體，結(jié)構(gòu)相當(dāng)復(fù)雜，又分為照明系統(tǒng)、成像系統(tǒng)和觀察記錄系統(tǒng)。主要分為透射電子顯微電鏡、掃描電子顯微電鏡、分析電子顯微鏡和高壓電子顯微鏡。廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)生物學(xué)等各個學(xué)科，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科學(xué)研究和臨床疾病的診斷中發(fā)揮著重要的作用。它包括普通樣品制備技術(shù)（如超薄切片技術(shù)）和特殊樣品制備技術(shù)（如電鏡酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)）。三、電子顯微鏡技術(shù)電子顯微鏡技術(shù)簡稱電鏡技術(shù)，它包括電子顯微鏡(electron microscope )和樣品制備技術(shù)（techniques of sample preparation）兩大方面。（3）LSCM的高靈敏度、高分辨率和高放大倍數(shù)，減少了光淬滅的影響，提供了普通光學(xué)顯微鏡無法顯示的結(jié)構(gòu)信息，并適用于達到毫秒級的快速變化檢測。激光通過聚光鏡焦平面上針孔形成點光源經(jīng)物鏡在焦平面上對樣品進行逐點掃描，樣品上每個照射點，反射后經(jīng)過物鏡折射到像焦平面的探測針孔處成像，經(jīng)空間濾波后，有效地抑制同焦平面上非測量光點形成的雜散熒光和樣品的不同焦平面發(fā)射來的干擾熒光。與普通光鏡和熒光顯微鏡相比有一些明顯的優(yōu)點，其中主要有：（1）普通顯微鏡使用的光源為鹵素?zé)簦庾V范圍寬，成象時樣品上每個照光點均會受到色差影響以及由照射光引起的散射和衍射的干擾，影響成象質(zhì)量。（五）激光掃描共焦顯微鏡 激光掃描共焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope，LSCM)，也被稱為激光掃描細(xì)胞儀(laser scanning cytometer，LSC)。微分干涉差顯微鏡利用的是偏振光，這些光經(jīng)棱鏡折射后分成兩束，在不同時間經(jīng)過樣品的相鄰部位，然后在經(jīng)過另一棱鏡將這兩束光匯合，從樣品中厚度上的微小區(qū)別就會轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別，增加了樣品反差并且具有很強的立體感。最后這兩組光線經(jīng)過透鏡又會聚成一束，發(fā)生互相疊加或抵消的干涉現(xiàn)象，從而表現(xiàn)出肉眼明顯可見的明暗區(qū)別。(三)相差顯微鏡技術(shù) 相差顯微鏡（phase contrast microscope）是一種可以觀察活細(xì)胞或未經(jīng)染色的標(biāo)本的顯微鏡。 ⑵ 誘發(fā)熒光 通過誘導(dǎo)劑作用而發(fā)的熒光，如甲醛蒸氣處理可誘發(fā)細(xì)胞和組織中生物單胺類產(chǎn)生熒光。 （二）熒光顯微鏡技術(shù)熒光顯微鏡（fluorescent microscope）是以各種特定波長光源激發(fā)生物標(biāo)本中的熒光物質(zhì)，產(chǎn)生各種可見顏色熒光的一種顯微鏡。 用于普通光學(xué)顯微鏡觀察的生物樣品必須應(yīng)過一系列的組織處理并制成1～10181。目前光學(xué)顯微鏡已發(fā)展成多種類型，用于各類不同的研究目的。掃描探針顯微鏡的制作原理與光鏡和電鏡完全不同，如掃描隧道顯微鏡是利用量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)原理制作成的，是目前分辨率最高的一類顯微鏡。這是由于光波具有衍射現(xiàn)象，當(dāng)光波波長大于物體二倍時，光波能繞過物體前進，就像沒有遇到物體一樣，所以在光鏡下看不清直徑小于波長一半的物體。光學(xué)顯微鏡的分辨率與光波波長，物鏡數(shù)值孔徑有關(guān)，可用Abbe公式表示： d = n sinq d為分辨率，ｎ為物鏡與物體間介質(zhì)折射率,空氣為1，θ為光束進入物鏡的半角，sinθ小于１(以極值1代入公式)。20世紀(jì)30年代，德國的Ruska發(fā)明了電子顯微鏡，突破了光鏡的局限，其分辨率可達2nm左右，使人們對于細(xì)胞結(jié)構(gòu)認(rèn)識逐步深入到超微觀世界。圖21顯示了不同分辨率時所看到的拇指表皮結(jié)構(gòu)，從大體、顯微、亞顯微、一直到分子、原子水平。在光學(xué)顯微鏡下看到的細(xì)胞結(jié)構(gòu)稱為細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)（microscopic structure），由于受到分辨率的限制，如生物膜、細(xì)胞骨架和一些細(xì)胞器等。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可將細(xì)胞在體外環(huán)境中生長，在體外研究細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能和生命活動規(guī)律，而細(xì)胞工程技術(shù)則可人為地將細(xì)胞進行改造，以獲得具有特定生物學(xué)特性的細(xì)胞。第二章 細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展是與實驗技術(shù)的進步密切相關(guān)的，細(xì)胞生物學(xué)的每一個重大進展都是由于引入了新的研究技術(shù)的結(jié)果。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，更有力地推動了細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展。電子顯微鏡下則可以觀察到這些光學(xué)顯微鏡下看不到的結(jié)構(gòu)，稱為細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)（submicroscopic structure）。參照前書圖參照前書圖21圖21 細(xì)胞與原子比例圖 （引自Alberts等，2002）參照前書圖21一、 顯微鏡與分辨率人類最初只是用肉眼直接觀察周圍世界，可是人眼觀察事物的能力是有限的，一般情況下在25cm的明視距離內(nèi)，～，如果小于這一距離，人的眼睛就不能分辨。20世紀(jì)80年代IBM蘇黎世實驗室的Binning等人發(fā)明了掃描隧道顯微鏡， 左右，可直接觀察DNA、RNA等生物大分子及生物膜等結(jié)構(gòu)。代入公式： d = ／＝因此在光學(xué)顯微鏡中，λ越短，分辨率越高；n和θ越大，分辨率也越高。當(dāng)物體直徑小于200nm（）就分辨不清。～；。在細(xì)胞生物學(xué)中常用的有普通光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、相差顯微鏡，以及暗視野顯微鏡和微分干涉差顯微鏡。m的切片。熒光顯微鏡一般采用高壓汞燈和弧光燈作為光源，在光源和反光鏡之間放一組濾色片以產(chǎn)生特定波長的激發(fā)光，光譜一般從紫外到紅外，從而激發(fā)各種熒光物質(zhì)產(chǎn)生不同波長的發(fā)射光。⑶ 熒光染料染色熒光 例如吖啶橙可以對細(xì)胞DNA、RNA同時染色，顯示不同顏色的熒光，DNA呈綠色熒光，RNA呈橙色熒光。相差顯微鏡能夠改變直射光的相位，并且利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相差變成振幅差（明暗差），同時它還吸收部分直射光線以增大其明暗反差。觀察活體細(xì)胞常采用倒置相差顯微鏡，它與一般相差顯微鏡的不同是光源和聚光器裝在上方，相差物鏡裝在載物臺下方，便于觀察在培養(yǎng)瓶中貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，這樣可清楚地分辨細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞核、核仁以及胞質(zhì)中存在的顆粒，甚至研究細(xì)胞核、線粒體等細(xì)胞器的動態(tài)。微分干涉顯微鏡能使細(xì)胞核及較大的細(xì)胞器如線粒體等具有較強的立體感，比較適合于顯微操作。自20世紀(jì)70年代問世以來很快得到迅速發(fā)展，成為分子細(xì)胞生物學(xué)的新一代研究工具。LSCM的光源為激光，是單色性好的平行光，基本消色差，成象聚焦后焦深小，縱向分辨率高，可無損傷地對樣品作不同深度的層掃描和熒光強度測量。每個像點被光電倍增管(PMT)或冷電感藕合器件(cCCD)探測器接收。 圖22 激光掃描共焦顯微鏡物像共軛原理圖參照前書圖22LSCM最常用的功能是熒光檢測、三維重建和顯微操作等。電子顯微鏡的基本原理與光學(xué)顯微鏡相同（圖2—3），但光源和透鏡有所不同，電鏡利用電子束作光源，電磁場做透鏡，因而最佳分辨率可達12 197。第一臺電鏡誕生于1931年，至今已有70余年的歷史，經(jīng)過不斷的改進和提高已從最初的一種電鏡發(fā)展為多種電鏡，分辨率可達到1197。圖23 光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡結(jié)構(gòu)原理圖參照前書圖23 （一）電子顯微鏡的種類 電子顯微鏡是以電子束作光源、電磁場作透鏡、具有高分辨率和放大倍率的顯微鏡。 透射電子顯微電鏡 透射電子顯微電鏡（transmmision electron microscope），是發(fā)展最早、應(yīng)用最廣泛的電鏡，一般所說的電鏡指的便是透射電鏡。照明系統(tǒng)由電子槍和聚光鏡組成，電子槍發(fā)射電子作為電鏡的照明光源。成像系統(tǒng)的總放大倍率是物鏡、中間鏡和投影鏡放大倍數(shù)的乘積。電鏡有復(fù)雜的真空系統(tǒng)和電路系統(tǒng)以維持鏡筒的高真空狀態(tài)和穩(wěn)定的工作條件。電子探針受掃描發(fā)生器控制，在樣品表面進行逐點掃描，把樣品表面的原子外層的電子擊出，形成二次電子，二次電子被二次電子檢測器收集、轉(zhuǎn)換、放大、轉(zhuǎn)換到顯象管，由于顯象管的熒光屏上的畫面與樣品被電子束照射面呈嚴(yán)格同步掃描，逐點逐行一一對應(yīng)，這樣就能看出樣品表面形貌。它可以裝配在透射電鏡上，也可以裝配在掃描電鏡上。從而獲知結(jié)構(gòu)變化與其組成的元素變化的關(guān)系，它的分辨率很高，元素周期表上大部分元素都能分辨出來。但電鏡體積龐大，價格昂貴，難以普及。由于電子束穿透能力的限制透射電鏡觀察的樣品必須很薄，普通光鏡切片厚度約3～5181。電鏡樣品采用戊二醛和鋨酸雙重固定，用酒精或丙酮脫水，環(huán)氧樹脂進行包埋，超薄切片機切片，采用重金屬如鈾和鉛進行染色以增加細(xì)胞結(jié)構(gòu)間的反差。負(fù)染色技術(shù)主要用于細(xì)菌、病毒、噬菌體等微生物大分子結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞碎片以及分離的細(xì)胞器等研究工作。 掃描電鏡樣品制備技術(shù) 掃描電鏡適合于研究生物樣品的表面特征，樣品制備包括觀察面的暴露、固定、脫水、干燥和導(dǎo)電等。所以多采用液體CO2臨界點干燥法，在臨界狀態(tài)時表面張力系數(shù)為零，也就是分子的內(nèi)聚力等于零時干燥，細(xì)胞不再收縮，保持了原有的形態(tài)。 （一）掃描隧道顯微鏡 掃描隧道顯微鏡是掃描探針顯微鏡家族中的第一個成員，是由 G Binnig 和H Rohrer在1981年發(fā)明的，他們因此而獲得諾貝爾物理學(xué)獎。通過記錄隧道電流的變化就可以獲得樣品表面的微觀信息。在恒高模式中，針尖始終保持在樣品上方一個恒定的高度上，隧道電流隨著樣品表面形貌等微觀特性的改變而變化，通過檢測每個測量點上的電流變化來獲得樣品表面微觀信息。通過檢測微懸臂背面反射出的激光光點在光學(xué)檢測器上的位置變化，可以轉(zhuǎn)換成力的變化，因為反射光點的位置變化或微懸臂彎曲變化與力的變化成正比。在恒力模式中，通過精確控制掃描頭隨樣品表面形貌變化在縱向上下移動，微持微懸臂所受作用力的恒定，從掃描頭的縱向移動值得出樣品表面的形貌像。近年來，在其他方面也展開了積極的才探索，如將AFM用于研究生物大分子之間的相互作用、研究生物結(jié)構(gòu)的納米操作、研究活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能以及用于醫(yī)學(xué)和藥物學(xué)研究等。早期的酶細(xì)胞化學(xué)工作是在光學(xué)顯微鏡下進行的，稱為組織化學(xué)（histochemistry），隨著電鏡技術(shù)的發(fā)展開始用電鏡觀察酶的分布，稱為電鏡酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（electron microscopic enzyme cytochemistry）。 （一）酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的原理 顯微鏡下無法直接觀察到細(xì)胞內(nèi)的酶，通過酶細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)才能間接地反應(yīng)酶的存在位置。捕捉反應(yīng)的目的是使酶反應(yīng)產(chǎn)物形成在顯微鏡下可見的最終反應(yīng)產(chǎn)物，即最終反應(yīng)產(chǎn)物在光鏡下具有鮮明顏色，在電鏡下具有高電子密度。在生物化學(xué)中，酶被分成水解酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、裂合酶、合成酶和異構(gòu)酶六大類。酶細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)酶細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)實際上就是孵育反應(yīng)的過程，孵育液的成分主要有酶的底物、捕捉劑，保證孵育液pH 的緩沖液以及有關(guān)的添加劑等。它包括光鏡水平（簡稱免疫組化）和電鏡水平(簡稱免疫電鏡)的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。所以，細(xì)胞中的任何分子，只要其結(jié)構(gòu)復(fù)雜到一定程度，具有免疫原性，能作為抗原或半抗原，從而能導(dǎo)致針對它的抗體產(chǎn)生，都能作為靶分子，用該技術(shù)得到檢測。當(dāng)這一重組DNA在培養(yǎng)細(xì)胞中表達時，可以因為含有特異抗原或半抗原多肽，而能用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測到，因而重組蛋白質(zhì)也就能在同處被檢測到。針對抗原的抗體稱為第一抗體，針對第一抗體的抗體稱為第二抗體。常用的標(biāo)記酶如辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase）與其底物H2O2和氨基聯(lián)苯胺相遇時，形成的棕色沉淀可在光鏡下觀察到，遇鋨酸反應(yīng)后形成鋨黑電鏡下呈高電子密度。常用的親和物質(zhì)系統(tǒng)有生物素－親和素系統(tǒng)、葡萄球菌A蛋白－免疫球蛋白系統(tǒng)。這種方法因為在第一抗體上可以結(jié)合多個標(biāo)記的第二抗體，所以其靈敏度比直接法更高（圖2－6）圖2－6 間接法檢測抗原示意圖 參照前書圖25 （二）實驗方法 免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的實驗方法包括標(biāo)記抗體的準(zhǔn)備、組織樣品的制備及免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)。常用的光鏡固定劑為多聚甲醛，冷凍切片或常規(guī)石蠟包埋、切片；電鏡樣品多選用多聚甲醛與低濃度戊二醛（～%）混合液，鋨酸損傷抗原性，不能在細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)前使用。放射自顯影技術(shù)有光鏡和電鏡兩個層次。 (一) 放射自顯影技術(shù)基本原理放射自顯影技術(shù)基本原理是：將放射性核素標(biāo)記的物質(zhì)引入生物體或細(xì)胞，參與細(xì)胞的正常代謝過程，或聯(lián)結(jié)到能與特異大分子結(jié)合的探針上，利用放射性核素放出的射線作用于核子乳膠而顯像，從而達到對該放射性物質(zhì)在組織或細(xì)胞內(nèi)定位的目的，因此，放射性核素對核子乳膠的作用是放射自顯影技術(shù)的關(guān)鍵。β射線具有較大的穿透本領(lǐng)和較小的電離作用，在放射自顯影技術(shù)中有重要意義，在組成生物大分子的主要元素中都有發(fā)射β射線的核素如3H、32P、33P和35S等，是放射自顯影的重要工具。圖2－7 核素對核子乳膠的作用 參照前書圖26（二）實驗方法 放射自顯影的主要步驟包括：放射核素的標(biāo)記、樣品制備、核子乳膠膜的制備、自顯影和顯影及定影等。方法是給動物注射示蹤化合物，或?qū)ε囵B(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)液中加入示蹤化合物。制備乳膠膜需在暗室內(nèi)安全燈光下進行。 顯影和定影 經(jīng)過帶電粒子作用而在核子乳膠的鹵化銀晶體中所產(chǎn)生的潛影，必須經(jīng)過顯影和定影才能把“像”顯示出來。特別是配合使用能定位特異蛋白分子的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，就能對生理或病理條件下從DNA到mRNA到蛋白質(zhì)這樣一個基因表達過程進行定