【文章內容簡介】 電鏡樣品： 固定（酶固定＋結構固定）→切組織片→細胞化學反應 （酶反應＋捕捉反應）→脫水包埋→ 超薄切片→電鏡觀察二、 免疫細胞化學技術免疫細胞化學技術（immunocytochemistry）是根據免疫學原理，利用抗原抗體特異結合的特性定位組織和細胞中特異大分子的一類技術。它包括光鏡水平（簡稱免疫組化）和電鏡水平(簡稱免疫電鏡)的免疫細胞化學技術。應用免疫細胞化學技術可在原位檢測細胞的各種大分子，如蛋白質、多肽、核酸、多糖和磷脂等。 （一）免疫細胞化學技術的原理免疫細胞化學技術的原理是：把組織中的特異分子作為抗原，用各種在顯微鏡下可見的標記物標記特異抗體或標記抗原抗體復合物，使特異的免疫化學反應具有可見性，從而間接地顯示抗原，達到在細胞或細胞器水平定位特異分子的目的。1． 抗原用免疫細胞化學技術檢測的分子可以是各種大分子，它們在這一技術中扮演抗原的角色。所以，細胞中的任何分子，只要其結構復雜到一定程度，具有免疫原性，能作為抗原或半抗原，從而能導致針對它的抗體產生，都能作為靶分子，用該技術得到檢測。它們可以是蛋白質、多肽、核酸、多糖和磷脂等，最常見的待檢分子是蛋白質、多肽。除了檢測組織和細胞中天然存在的蛋白質、多肽，該技術還能檢測在培養(yǎng)細胞中人為表達的重組蛋白質分子。方法是利用分子生物學技術制備重組DNA時導入一段序列，該序列編碼一個多肽與重組蛋白質連接在一起，該多肽作為抗原或半抗原能導致針對它的抗體產生。當這一重組DNA在培養(yǎng)細胞中表達時，可以因為含有特異抗原或半抗原多肽，而能用免疫細胞化學技術檢測到，因而重組蛋白質也就能在同處被檢測到。免疫細胞化學技術的這種巧妙應用，近來在研究新克隆得到的蛋白質分子的定位中發(fā)揮很大作用，也為該技術開拓了更廣闊的應用空間。2． 抗體單克隆和多克隆抗體，可從市售獲得或自行制備。在免疫細胞化學技術中可以有兩個層次的抗體。針對抗原的抗體稱為第一抗體，針對第一抗體的抗體稱為第二抗體。3．免疫細胞化學中的標記物 免疫細胞化學技術是用已知的抗體檢測組織與細胞中相應抗原的方法，但抗原抗體相結合的復合物在顯微鏡下是看不見的，必須用特殊的標記物對抗體或抗原抗體復合物進行標記，才能使抗原抗體復合物在顯微鏡下具有可見性。常用的標記物有以下幾種：1 熒光素 用熒光素標記已知抗體，再與組織或細胞中的相應抗原結合，在熒光顯微鏡下檢測熒光素所發(fā)熒光，便可知抗原的分布部位，常用的熒光素有綠色熒光的異硫氰酸熒光素和紅色熒光的羅達明B200等。2 酶 用酶標記已知抗體，再與組織或細胞中的相應抗原結合，利用酶細胞化學方法顯示該標記酶以達到顯示抗原的目的。常用的標記酶如辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase）與其底物H2O2和氨基聯苯胺相遇時，形成的棕色沉淀可在光鏡下觀察到，遇鋨酸反應后形成鋨黑電鏡下呈高電子密度。3 膠體金 將膠體金與抗體結合形成金標記抗體，再與相應的抗原結合，形成顯微鏡下可見的電子致密的金顆粒。常用的膠體金顆粒直徑為5～60nm。 4 親和物質 親和物質是一種有多價能力的物質，不僅與另一種親和物質有高度的親和力，而且可與抗體蛋白及各種標記物如熒光素、酶、膠體金等結合，因而可以通過熒光顯微鏡、酶加底物顯色反應等定位某種特異分子。常用的親和物質系統有生物素－親和素系統、葡萄球菌A蛋白－免疫球蛋白系統。5 鐵蛋白 將鐵蛋白通過一種低分子的雙功能試劑與抗體相結合，它既保留了抗體的免疫活性又具有顯微鏡下可見的高電子密度核心。免疫細胞化學中的直接法和間接法直接法：用標記的特異抗體直接檢測相應抗原的方法稱為直接法。間接法：用未標記的特異抗體（第一抗體）與組織中的抗原結合，再用標記的第二抗體與第一抗體結合，間接檢測組織中的抗原。這種方法因為在第一抗體上可以結合多個標記的第二抗體，所以其靈敏度比直接法更高（圖2－6）圖2－6 間接法檢測抗原示意圖 參照前書圖25 （二）實驗方法 免疫細胞化學技術的實驗方法包括標記抗體的準備、組織樣品的制備及免疫細胞化學反應。標記抗體準備 抗體標記的基本方法是利用分子間電荷等作用力或使用交聯劑，將抗體與標記物連接在一起。但在絕大多數情況下，標記抗體從市場購得。樣品制備 樣品固定時既要保存好組織細胞結構和抗原位置又要保存好抗原性。常用的光鏡固定劑為多聚甲醛，冷凍切片或常規(guī)石蠟包埋、切片；電鏡樣品多選用多聚甲醛與低濃度戊二醛（～%）混合液，鋨酸損傷抗原性，不能在細胞化學反應前使用。電鏡免疫細胞化學反應可在未經包埋的組織片上進行，稱包埋前技術；也可在超薄切片上進行，稱包埋后技術。此外，冷凍超薄切片可直接用于電鏡免疫細胞化學反應?；緦嶒炦^程光鏡樣品 固定（抗原固定＋結構固定）→ 冷凍切片或石蠟包埋切片→免疫細胞化學反應→ 光鏡觀察電鏡樣品（包埋前技術）固定（抗原固定＋結構固定）→切組織片→免疫細胞化學反應→脫水包埋→超薄切片→電鏡觀察電鏡樣品（包埋后技術）固定（抗原固定＋結構固定）→脫水包埋→超薄切片→免疫細胞化學反應→電鏡觀察三、放射自顯影技術 放射自顯影（radioautography）是利用放射性核素（同位素）的射線作用于感光材料的鹵化銀晶體，產生潛影，然后通過顯影過程把“像”顯示出來，以研究用放射性核素標記的物質在生物體內的定位和定量的一種技術。放射自顯影技術有光鏡和電鏡兩個層次。光鏡放射自顯影研究同位素標記物在組織和細胞中的分布；電鏡放射自顯影研究同位素標記物在細胞超微結構水平上的分布。 放射自顯影技術通過標記大分子的前體（precursor）來示蹤大分子代謝的過程，分析它們不同時期在不同組織、細胞或細胞器中被攝取、轉運、貯存及排出的動態(tài)變化，從而在不破壞組織和細胞結構的情況下了解細胞、組織和器官的代謝狀態(tài)，如用放射性DNA前體3H胸腺嘧啶核苷酸標記細胞了解DNA的合成情況等。另外，也可以將放射性核素聯結到能與特異大分子結合的探針上，顯示特異大分子的定位和定量，如用35S標記的脫氧胞嘧啶核苷參入探針DNA分子，通過原位雜交使這一放射性探針與特異DNA或RNA分子結合，再通過放射自顯影顯示特異核酸分子在組織或細胞內的分布。 (一) 放射自顯影技術基本原理放射自顯影技術基本原理是：將放射性核素標記的物質引入生物體或細胞，參與細胞的正常代謝過程，或聯結到能與特異大分子結合的探針上，利用放射性核素放出的射線作用于核子乳膠而顯像，從而達到對該放射性物質在組織或細胞內定位的目的，因此，放射性核素對核子乳膠的作用是放射自顯影技術的關鍵。 核子乳膠 核子乳膠是鹵化銀晶體在明膠中形成的懸浮體，顆粒細小而均勻，具較好的靈敏度，能精確地測定顯影顆粒的密度、離子射程和徑跡的擴散。 放射性核素放出的射線 放射性核素在進行蛻變時主要放出三種射線，α、β、和γ射線。三種射線都能對感光材料發(fā)生作用，但情況各不相同。β射線具有較大的穿透本領和較小的電離作用，在放射自顯影技術中有重要意義，在組成生物大分子的主要元素中都有發(fā)射β射線的核素如3H、32P、33P和35S等，是放射自顯影的重要工具。 射線對核子乳膠的作用 放射自顯影的過程和普通的照相過程很相似。射線作用于核子乳膠時，帶電粒子和鹵化銀發(fā)生作用，把鹵離子的一個軌道電子擊出，使其成為鹵原子，而被擊出的電子為鹵離子周圍的銀離子所俘獲，使銀離子變成銀原子。這就是潛影形成的過程，再經過顯影和定影，影像就呈現出來（圖27）。圖2－7 核素對核子乳膠的作用 參照前書圖26（二）實驗方法 放射自顯影的主要步驟包括：放射核素的標記、樣品制備、核子乳膠膜的制備、自顯影和顯影及定影等?，F以電鏡放射自顯影為例作簡單介紹。 放射性核素標記所要研究的大分子 含有放射性核素、用來示蹤大分子的物質叫作示蹤化合物。要研究大分子的代謝過程，所選擇的示蹤化合物必須是所研究大分子的前體。方法是給動物注射示蹤化合物，或對培養(yǎng)細胞在培養(yǎng)液中加入示蹤化合物。要研究已合成的大分子的定位，則可以通過酶促反應令示蹤化合物參入探針，再通過原位雜交反應令放射性探針與所要研究的大分子結合。 樣品制備 電鏡放射自顯影中的樣品制備過程與普通樣品制備技術相同。 涂覆核子乳膠膜 在帶有放射性核素的切片上覆蓋一層核子乳膠膜，然后進行自顯影過程。制備乳膠膜需在暗室內安全燈光下進行。制備方法包括環(huán)套法、浸涂法、平基法等。 自顯影過程（曝光） 自顯影指在無光條件（暗盒內）下讓切片中放射性核素發(fā)射出來的帶電粒子和乳膠中鹵化銀晶體作用的過程。自顯影過程一般在低溫（4℃）和干燥的條件下進行。 顯影和定影 經過帶電粒子作用而在核子乳膠的鹵化銀晶體中所產生的潛影，必須經過顯影和定影才能把“像”顯示出來。顯影的作用是使?jié)撚白兂刹环€(wěn)定的影像，而定影使已顯影的影像穩(wěn)定下來。 基本實驗過程用于大分子合成過程研究的放射自顯影技術： 同位素標記示蹤化合物→注入動物體內→ 取下器官或組織→切片→ 涂乳膠膜→自顯影→顯影和定影→染色→觀察用于大分子定位研究的放射自顯影技術：組織固定包埋→切片 ↓ 細胞化學反應→涂乳膠膜→自顯影→顯影和定影→染色→觀察 ↑ 同位素標記示蹤化合物四、原位雜交技術 原位雜交技術（in situ hybridization）是以標記的核酸分子為探針，在組織細胞原位檢測特異核酸分子的技術。這一技術不需要從組織細胞中提取核酸，對組織中含量極低的靶序列有很高的靈敏度，并可保持組織與細胞的結構完整，反映特異核酸分子的定位。特別是配合使用能定位特異蛋白分子的免疫細胞化學技術，就能對生理或病理條件下從DNA到mRNA到蛋白質這樣一個基因表達過程進行定性和定位的分析，是基因表達研究強有力的手段。 （一）原位雜交技術的原理 原位雜交技術的原理是：使含有特異序列、經過標記的核酸單鏈即探針，在適宜條件下與組織細胞中的互補核酸單鏈即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細胞化學方法對標記探針進行探測，從而在細胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。 核酸分子雜交 DNA雙鏈分子在一定條件下可以發(fā)生變性和復性的過程。分子雜交技術利用的就是兩條互補的DNA單鏈能夠復性的性質。分子雜交是堿基互補的兩條異質核酸單鏈在一定條件下締合形成雙鏈分子的過程。這一過程相當于DNA的復性，只是核酸單鏈的來源不同。 原位雜交技術中，以經過標記的已知核酸分子為探針，以細胞內與探針序列互補的特異核酸分子為靶分子，造成一定條件使探針與靶核酸分子在原位發(fā)生雜交，然后再對其探測 (圖28)。 圖28 原位雜交原理圖參照前書圖27 探針標記 探針是經過標記的核酸分子，與待測DNA或RNA序列互補。探針主要有cDNA、RNA和寡核苷酸。 探針標記物有放射性的和非放射性的兩類。常用的放射性標記物主要有35S、32P、33P和3H。非放射性標記物主要有熒光素、生物素、地高辛和溴脫氧尿嘧啶等。通常標記物被導入某個單核苷酸而形成標記分子，如四甲基羅達明UTP、生物素UTP、地高辛dUTP等。然后通過各種酶促反應，如隨機引物法或PCR法，使標記分子參入探針。 雜交 不同來源的序列互補的單鏈核酸分子在一定條件下借氫鍵相連而形成雙鏈雜交分子的過程為雜交。雜交可發(fā)生于RNA與DNA、DNA與DNA、RNA與RNA之間。形成的雙鏈雜交分子為雜交體（hybrids）。雜交體的探測 對雜交體的探測根據探針標記物的不同而采用各種方法，目的是使標記的雜交體在光鏡或電鏡下可見。⑴ 放射自顯影 如果探針是同位素標記的，顯示雜交反應的方法就是光鏡或電鏡水平的放射自顯影技術。方法是在切片上涂覆核子乳膠膜后置于暗盒中于4℃自顯影一段時間，然后經顯影和定影后觀察銀離子在細胞和細胞器分布情況。⑵ 免疫細胞化學 對于非同位素標記的探針，可根據免疫細胞化學原理用直接法或間接法將探針標記物顯示出來。也就是采用那些在光鏡或電鏡下具有可見性的免疫細胞化學標記物來直接或間接地顯示雜交探針標記物。如用地高辛標記探針雜交后，需加入堿性磷酸酶聯結的抗地高辛抗體，再加入酶的底物來顯示雜交體。 （二）實驗方法 原位雜交技術的實驗方法主要包括：標記探針的準備，組織樣品制備，雜交和雜交體探測。1． 標記探針的準備 對cDNA、RNA和寡核苷酸三種探針的選擇，要考慮所要檢測的靶核酸分子的性質，如cDNA 和RNA 適宜于檢測mRNA分子，寡核苷酸對mRNA的雜交效率和特異性都不如RNA探針。 2．組織樣品制備 光鏡原位雜交標本的固定多使用4%多聚甲醛，常規(guī)石蠟包埋和切片，但在操作過程中應提防RNA酶污染。電鏡原位雜交標本的固定也采用4%多聚甲醛。與免疫細胞化學技術一樣，電鏡水平的原位雜交可以在未經包埋的組織切片上進行，稱包埋前技術；也可以在超薄切片上進行，稱包埋后技術。冷凍切片能較好的保存靶核酸因而較易獲得雜交信號，但對細胞結構的保存較差。3． 雜交 雜交是在一定溫度和離子強度條件下讓標記探針與組織中靶分子結合的過程。雜交的效率和特異性是優(yōu)化雜交條件的出發(fā)點，也是需要兼顧的兩個方面。影響因素主要是探針的結構、雜交溫度、雜交液中的甲酰胺濃度和離子強度、雜交后漂洗等。要通過實驗對條件進行優(yōu)化。