【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 勿稀釋藥液七、作業(yè)：繪制洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞的細(xì)胞骨架圖。實(shí)驗(yàn)八、線粒體和液泡系的超活染色與觀察一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?觀察動(dòng)、植物活細(xì)胞內(nèi)線粒體、液泡系的形態(tài)、數(shù)量與分布。 學(xué)習(xí)一些細(xì)胞器的超活染色技術(shù)。二、 實(shí)驗(yàn)原理： 活體染色是指對(duì)生活有機(jī)體的細(xì)胞或組織能著色但又無(wú)毒害的一種染色方法。它的目的是顯示生活細(xì)胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)，而不影響細(xì)胞的生命活動(dòng)和產(chǎn)生任何物理、化學(xué)變化以致引起細(xì)胞的死亡。活染技術(shù)可用來(lái)研究生活狀態(tài)下的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理、病理狀態(tài)。根據(jù)所用染色劑的性質(zhì)和染色方法的不同，通常把活體染色分為體內(nèi)活染與體外活染兩類。體內(nèi)活染是以膠體狀的染料溶液注入動(dòng)、植物體內(nèi)，染料的膠粒固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊結(jié)構(gòu)里，達(dá)到易于識(shí)別的目的。體外活染又稱超活染色，它是由活的動(dòng)、植物分離出部分細(xì)胞或組織小塊，以染料溶液浸染，染料被選擇固定在活細(xì)胞的某種結(jié)構(gòu)上而顯色。活體染料之所以能固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊的部位，主要是染料的“電化學(xué)”特性起重要作用。堿性染料的膠粒表面帶陽(yáng)離子，酸性染料的膠粒表面帶陰離子，而被染的部分本身也是具有陰離子或陽(yáng)離子的，這樣，它們彼此之間就發(fā)生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作為活體染色劑之用，應(yīng)選擇那些對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性或毒性極小的染料，而且總是要配成稀淡的溶液來(lái)使用。一般是以堿性染料最為適用，可能因?yàn)樗鼈兙哂腥芙庠陬愔|(zhì)（如卵磷脂、膽固醇等）的特性，易于被細(xì)胞吸收。詹納斯綠B（Janus green B）和中性紅（neutral red）兩種堿性染料是活體染色劑中最重要的染料，對(duì)于線粒體和液泡系的染色各有專一性。三、 實(shí)驗(yàn)用品： 器材：顯微鏡、恒溫水浴鍋、載玻片、蓋玻片、10ml量筒、吸管、牙簽、吸水紙（或衛(wèi)生紙）等。 試劑：1） Ringer溶液（裝入滴瓶）氯化鈉 085g（變溫動(dòng)物用065g）氯化鉀 025g氯化鈣 003g蒸餾水 100ml2） 1%、1/3000中性紅溶液（裝入棕色滴瓶）稱取05g中性紅溶于50mlRinger液，稍加熱（3040℃）使之很快溶解，用濾紙過(guò)濾，裝于棕色瓶于暗處保存，否則易氧化沉淀，失去染色能力。臨用前，取已配制的1%中性紅溶液1ml，加入29mlRinger溶液混勻，裝入棕色瓶備用。3） 1%、1/5000詹納斯綠B溶液（裝入棕色滴瓶） 稱取50mg詹納斯綠B溶于5mlRinger溶液中，稍加熱（3040℃），使之溶解，用濾紙過(guò)濾后，即為1%原液。取1%原液1ml加入49mlRinger溶液，即成1/5000工作液，裝入瓶中備用。最好現(xiàn)用現(xiàn)配，以保持它的充分氧化能力。四、 實(shí)驗(yàn)材料：人口腔上皮細(xì)胞洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞小麥或黃豆幼根根尖五、 方法步驟：（一）、線粒體的超活染色與觀察：線粒體是細(xì)胞進(jìn)行呼吸作用的場(chǎng)所，其形態(tài)和數(shù)量隨不同物種、不同組織器官和不同的生理狀態(tài)而發(fā)生變化。詹納斯綠B是毒性較小的堿性染料，可專一性地對(duì)線粒體進(jìn)行超活染色，這是由于線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素氧化酶系的作用，使染料始終保持氧化狀態(tài)（即有色狀態(tài)），呈藍(lán)綠色；而線粒體周圍的細(xì)胞質(zhì)中，這些染料被還原為無(wú)色的色基（即無(wú)色狀態(tài)）。 人口腔黏膜上皮細(xì)胞線粒體的超活染色觀察1）、取清潔載玻片放在37℃恒溫水浴鍋的金屬板上，滴兩滴1/5000詹納斯綠B染液。2）、實(shí)驗(yàn)者用牙簽寬頭在自己口腔頰黏膜處稍用力刮取上皮細(xì)胞，將刮下的黏液狀物放入載玻片的染液滴中，染色10——15分鐘（注意不可使染液干燥，必要時(shí)可再加滴染液），蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去四周溢出的染液，置顯微鏡下觀察。3）、在低倍鏡下，選擇平展的口腔上皮細(xì)胞，換高倍鏡或油鏡進(jìn)行觀察?？梢?jiàn)扁平狀上皮細(xì)胞的核周圍胞質(zhì)中，分布著一些被染成藍(lán)綠色的顆粒狀或短棒狀的結(jié)構(gòu)，即是線粒體。 洋蔥鱗莖表皮細(xì)胞線粒體的超活染色觀察1） 用吸管吸取1/5000詹納斯綠B染液，滴一滴于干凈的載玻片上，然后，撕取一小片洋蔥鱗莖內(nèi)表皮，置于染液中，染色10—15分鐘。2） 用吸管吸去染液，加一滴Ringer液，注意使內(nèi)表皮組織展平，蓋上蓋玻片進(jìn)行觀察。3） 在高倍鏡下，可見(jiàn)洋蔥表皮細(xì)胞中央被一大液泡所占據(jù)，細(xì)胞核被擠至一側(cè)貼細(xì)胞壁處。仔細(xì)觀察細(xì)胞質(zhì)中線粒體的形態(tài)與分布。（二）、液泡系的超活染色與觀察中性紅為弱減性染料，對(duì)液泡系的染色有專一性，只將活細(xì)胞中的液泡系染成紅色，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)完全不著色，這可能與液泡中某些蛋白質(zhì)有關(guān)。 小麥或黃豆根尖細(xì)胞液泡系的中性紅染色與觀察1） 實(shí)驗(yàn)前，將小麥或黃豆種子培養(yǎng)在培養(yǎng)皿內(nèi)潮濕的濾紙上，使其發(fā)芽，胚根伸長(zhǎng)到1cm以上。2） 取初生的小麥或黃豆幼苗根尖（約1—2cm長(zhǎng)）,置于載波片上,滴一滴Ringer液，用鑷子或刀片小心將根尖壓成一薄片，吸去Ringer液，在材料上滴一滴1/3000中性紅染液，染色5—10分鐘。3） 吸去染液，滴一滴Ringer液，蓋上蓋玻片，并用鑷子輕輕地下壓蓋玻片，使根尖壓扁，利于觀察。4） 在高倍鏡下，先觀察根尖部分的生長(zhǎng)點(diǎn)的細(xì)胞，可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)中散在很多大小不等的染成玫瑰紅色的圓形小泡，這是初生的幼小液泡。然后，由生長(zhǎng)點(diǎn)向延長(zhǎng)區(qū)觀察，在一些已分化長(zhǎng)大的細(xì)胞內(nèi)，液泡的染色較淺，體積增大，數(shù)目變少。在成熟區(qū)細(xì)胞中，一般只有一個(gè)淡紅色的巨大液泡，占據(jù)細(xì)胞的絕大部分，將細(xì)胞核擠到細(xì)胞一側(cè)貼近細(xì)胞壁處。洋蔥表皮細(xì)胞液泡系的活體染色與觀察：1） 撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮2） 置于加有一滴1/3000的中性紅染液的載玻片中，染色5—10分鐘3） 用吸水紙吸去染液，換上Ringer液，蓋上蓋玻片4） 顯微鏡下觀察，可見(jiàn)被染成磚紅色的中央大液泡 六、注意事項(xiàng)： 在對(duì)口腔上皮細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)不可使染液干燥，可適當(dāng)補(bǔ)加染液。在對(duì)植物進(jìn)行觀察時(shí)一定要讓材料盡量展開(kāi)。七、作業(yè)： 繪口腔上皮細(xì)胞示線粒體形態(tài)與分布 繪小麥或黃豆根尖細(xì)胞示液泡系形態(tài)與分布實(shí)驗(yàn)九、DNA的細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)——Feulgen反應(yīng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^(guò)根尖壓片法，掌握Feulgen反應(yīng)顯示DNA的基本原理和主要操作環(huán)節(jié)二、實(shí)驗(yàn)原理：Feulgen反應(yīng)是1924年由Feulgen和Rossenbeck開(kāi)創(chuàng)的。這一反應(yīng)的原理是：DNA在一定的溫度（60℃）下，被酸水解，打開(kāi)嘌呤堿與脫氧核糖連接的鍵。在脫氧核糖的一端形成游離的醛基，醛基與Schiff試劑（脫色堿性品紅）結(jié)合，形成紫紅色化合物。所以，凡有DNA的部位，會(huì)呈現(xiàn)紫紅色陽(yáng)性反應(yīng)，可以作為定性研究DNA的一種簡(jiǎn)便方法。三、實(shí)驗(yàn)用品：（一）、藥品：Schiff試劑：稱1g堿性品紅，溶于200ml已煮沸的蒸餾水中（要漫漫加入，不可一下全部倒入），繼續(xù)煮沸5分鐘（攪動(dòng)），然后使其冷卻至50℃，過(guò)濾于棕色磨口瓶中，加入20ml1N HCl（取比重為119的HCl 325ml，加蒸餾水至1000ml即成），繼續(xù)冷卻至25℃時(shí)加入1g偏亞硫酸鉀（KHSO3）或偏亞硫酸鈉（NaHSO3），將瓶塞蓋嚴(yán)，置于暗處24小時(shí)，溶液應(yīng)為無(wú)色，可保持在14℃冰箱中備用。如果紅色不退可加入2g活性炭粉末，攪動(dòng)數(shù)分鐘后靜置數(shù)小時(shí)，再過(guò)濾即可脫去紅色。1N HCl：(應(yīng)將鹽酸緩緩加入水中)。45%醋酸亞硫酸水溶液：在200ml自來(lái)水中，加入10ml 10%的偏亞硫酸鈉（或偏亞硫酸鉀）溶液，或加入10ml 30%的偏重亞硫酸鈉溶液，再加入1N HCl 10ml即成，蓋緊瓶塞。此液要現(xiàn)配現(xiàn)用。Carnoy固定液：95%酒精3份，冰醋酸1份混合即可。50%酒精、30%酒精。5%三氯醋酸（二）、用具：顯微鏡、恒溫水浴鍋、鑷子、刀片、載玻片、蓋玻片、酒精燈、青霉素小瓶、吸水紙等四、實(shí)驗(yàn)材料：大蒜、洋蔥或蠶豆根尖五、方法步驟：取051cm的根尖，在carnoy固定液中固定224小時(shí)。固定時(shí)以冰箱中進(jìn)行為宜。取出固定材料，用50%酒精、30%酒精、蒸餾水各沖洗5分鐘，以除掉材料上的醋酸。準(zhǔn)備兩張切片，其中一張作對(duì)照。水解：用1N的冷HCl過(guò)洗材料一次，然后放入溫度穩(wěn)定在60℃的1N HCl中，水解1014分鐘，取出材料后再用1N冷HCl過(guò)一次。染色：將水解后的材料放入Schiff試劑中染色1小時(shí)左右，此時(shí)根尖部分會(huì)出現(xiàn)紫紅色。用亞硫酸水漂洗三次，每次5分鐘，使細(xì)胞質(zhì)的紫紅色退掉，再流水沖洗5—15分鐘，洗后的材料放入蒸餾水中。用45%的醋酸壓片。鏡檢。與對(duì)照裝片比較。對(duì)照切片的制做：進(jìn)行Feulgen反應(yīng)時(shí), 一般要做一對(duì)照切片以便驗(yàn)證反應(yīng)結(jié)果。對(duì)照切片可用下面兩種方法制作：不經(jīng)水解直接放入schiff試劑內(nèi)染色。 材料固定后用5%三氯醋酸于90℃處理15min，用蒸餾水沖洗，以后步驟同實(shí)驗(yàn)組。六、注意事項(xiàng)：Feulgen反應(yīng)的染色深淺與材料、水解時(shí)的溫度和時(shí)間都有關(guān)系。水解時(shí)間的長(zhǎng)短要根據(jù)固定液和材料來(lái)進(jìn)行選擇，時(shí)間太短則游離的醛基量少而染色不深，時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)因醛基進(jìn)一步變成其它物質(zhì)，染色也不深。水解時(shí)的溫度要嚴(yán)格控制。未經(jīng)水解的對(duì)照切片在schiff試劑中最多不要超過(guò)1 h ( h即可)，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，試劑本身的酸性也會(huì)使DNA水解，從而出現(xiàn)假的正反應(yīng)。 Schiff試劑的作用 ：Feulgen反應(yīng)成功與否的一個(gè)非常關(guān)鍵的因素，就是schiff試劑的質(zhì)量。有一大類試劑均稱為堿性品紅，它們實(shí)際上是由幾種產(chǎn)品分別組成的。因此只能選用注明“DNA染色反應(yīng)用”的堿性品紅才行。此外，Schiff試劑的配制方法也可影響DNA的染色反應(yīng)。七、作業(yè)：繪圖表示Feulgen反應(yīng)的染色結(jié)果, 并驗(yàn)交Feulgen反應(yīng)的壓片1張。 總結(jié)Feulgen反應(yīng)染色結(jié)果的影響因素。Feulgen反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)原理是什么？ 在稀鹽酸水解后，為什么要用亞硫酸水洗片？實(shí)驗(yàn)十、RNA的細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)——Unna反應(yīng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆诊@示細(xì)胞內(nèi)RNA和DNA的主要細(xì)胞化學(xué)方法以及了解RNA和DNA在細(xì)胞內(nèi)的一般分布狀況。二、實(shí)驗(yàn)原理： 1989年P(guān)appenheim首創(chuàng)了甲基綠派洛寧染色法。1902年Unna對(duì)這一方法進(jìn)行了改良。1940年Brachet研究證明甲基綠和派洛寧對(duì)DNA和RNA有選擇性的染色效果。這是一種利用堿性染料顯示細(xì)胞內(nèi)RNA的標(biāo)準(zhǔn)方法之一。其原理是：利用DNA