【文章內容簡介】 勿稀釋藥液七、作業(yè)：繪制洋蔥鱗莖內表皮細胞的細胞骨架圖。實驗八、線粒體和液泡系的超活染色與觀察一、 實驗目的： 觀察動、植物活細胞內線粒體、液泡系的形態(tài)、數(shù)量與分布。 學習一些細胞器的超活染色技術。二、 實驗原理： 活體染色是指對生活有機體的細胞或組織能著色但又無毒害的一種染色方法。它的目的是顯示生活細胞內的某些結構，而不影響細胞的生命活動和產(chǎn)生任何物理、化學變化以致引起細胞的死亡。活染技術可用來研究生活狀態(tài)下的細胞形態(tài)結構和生理、病理狀態(tài)。根據(jù)所用染色劑的性質和染色方法的不同，通常把活體染色分為體內活染與體外活染兩類。體內活染是以膠體狀的染料溶液注入動、植物體內，染料的膠粒固定、堆積在細胞內某些特殊結構里，達到易于識別的目的。體外活染又稱超活染色，它是由活的動、植物分離出部分細胞或組織小塊，以染料溶液浸染，染料被選擇固定在活細胞的某種結構上而顯色?；铙w染料之所以能固定、堆積在細胞內某些特殊的部位，主要是染料的“電化學”特性起重要作用。堿性染料的膠粒表面帶陽離子，酸性染料的膠粒表面帶陰離子，而被染的部分本身也是具有陰離子或陽離子的，這樣，它們彼此之間就發(fā)生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作為活體染色劑之用，應選擇那些對細胞無毒性或毒性極小的染料，而且總是要配成稀淡的溶液來使用。一般是以堿性染料最為適用，可能因為它們具有溶解在類脂質（如卵磷脂、膽固醇等）的特性，易于被細胞吸收。詹納斯綠B（Janus green B）和中性紅（neutral red）兩種堿性染料是活體染色劑中最重要的染料，對于線粒體和液泡系的染色各有專一性。三、 實驗用品： 器材：顯微鏡、恒溫水浴鍋、載玻片、蓋玻片、10ml量筒、吸管、牙簽、吸水紙（或衛(wèi)生紙）等。 試劑：1） Ringer溶液（裝入滴瓶）氯化鈉 085g（變溫動物用065g）氯化鉀 025g氯化鈣 003g蒸餾水 100ml2） 1%、1/3000中性紅溶液（裝入棕色滴瓶）稱取05g中性紅溶于50mlRinger液，稍加熱（3040℃）使之很快溶解，用濾紙過濾，裝于棕色瓶于暗處保存，否則易氧化沉淀，失去染色能力。臨用前，取已配制的1%中性紅溶液1ml，加入29mlRinger溶液混勻，裝入棕色瓶備用。3） 1%、1/5000詹納斯綠B溶液（裝入棕色滴瓶） 稱取50mg詹納斯綠B溶于5mlRinger溶液中，稍加熱（3040℃），使之溶解，用濾紙過濾后，即為1%原液。取1%原液1ml加入49mlRinger溶液，即成1/5000工作液，裝入瓶中備用。最好現(xiàn)用現(xiàn)配，以保持它的充分氧化能力。四、 實驗材料：人口腔上皮細胞洋蔥鱗莖內表皮細胞小麥或黃豆幼根根尖五、 方法步驟：（一）、線粒體的超活染色與觀察：線粒體是細胞進行呼吸作用的場所，其形態(tài)和數(shù)量隨不同物種、不同組織器官和不同的生理狀態(tài)而發(fā)生變化。詹納斯綠B是毒性較小的堿性染料，可專一性地對線粒體進行超活染色，這是由于線粒體內的細胞色素氧化酶系的作用，使染料始終保持氧化狀態(tài)（即有色狀態(tài)），呈藍綠色；而線粒體周圍的細胞質中，這些染料被還原為無色的色基（即無色狀態(tài)）。 人口腔黏膜上皮細胞線粒體的超活染色觀察1）、取清潔載玻片放在37℃恒溫水浴鍋的金屬板上，滴兩滴1/5000詹納斯綠B染液。2）、實驗者用牙簽寬頭在自己口腔頰黏膜處稍用力刮取上皮細胞，將刮下的黏液狀物放入載玻片的染液滴中，染色10——15分鐘（注意不可使染液干燥，必要時可再加滴染液），蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去四周溢出的染液，置顯微鏡下觀察。3）、在低倍鏡下，選擇平展的口腔上皮細胞，換高倍鏡或油鏡進行觀察?？梢姳馄綘钌掀ぜ毎暮酥車|中，分布著一些被染成藍綠色的顆粒狀或短棒狀的結構，即是線粒體。 洋蔥鱗莖表皮細胞線粒體的超活染色觀察1） 用吸管吸取1/5000詹納斯綠B染液，滴一滴于干凈的載玻片上，然后，撕取一小片洋蔥鱗莖內表皮，置于染液中，染色10—15分鐘。2） 用吸管吸去染液，加一滴Ringer液，注意使內表皮組織展平，蓋上蓋玻片進行觀察。3） 在高倍鏡下，可見洋蔥表皮細胞中央被一大液泡所占據(jù)，細胞核被擠至一側貼細胞壁處。仔細觀察細胞質中線粒體的形態(tài)與分布。（二）、液泡系的超活染色與觀察中性紅為弱減性染料，對液泡系的染色有專一性，只將活細胞中的液泡系染成紅色，細胞核與細胞質完全不著色，這可能與液泡中某些蛋白質有關。 小麥或黃豆根尖細胞液泡系的中性紅染色與觀察1） 實驗前，將小麥或黃豆種子培養(yǎng)在培養(yǎng)皿內潮濕的濾紙上，使其發(fā)芽，胚根伸長到1cm以上。2） 取初生的小麥或黃豆幼苗根尖（約1—2cm長）,置于載波片上,滴一滴Ringer液，用鑷子或刀片小心將根尖壓成一薄片，吸去Ringer液，在材料上滴一滴1/3000中性紅染液，染色5—10分鐘。3） 吸去染液，滴一滴Ringer液，蓋上蓋玻片，并用鑷子輕輕地下壓蓋玻片，使根尖壓扁，利于觀察。4） 在高倍鏡下，先觀察根尖部分的生長點的細胞，可見細胞質中散在很多大小不等的染成玫瑰紅色的圓形小泡，這是初生的幼小液泡。然后，由生長點向延長區(qū)觀察，在一些已分化長大的細胞內，液泡的染色較淺，體積增大，數(shù)目變少。在成熟區(qū)細胞中，一般只有一個淡紅色的巨大液泡，占據(jù)細胞的絕大部分，將細胞核擠到細胞一側貼近細胞壁處。洋蔥表皮細胞液泡系的活體染色與觀察：1） 撕取洋蔥鱗莖內表皮2） 置于加有一滴1/3000的中性紅染液的載玻片中，染色5—10分鐘3） 用吸水紙吸去染液，換上Ringer液，蓋上蓋玻片4） 顯微鏡下觀察，可見被染成磚紅色的中央大液泡 六、注意事項： 在對口腔上皮細胞進行染色時不可使染液干燥，可適當補加染液。在對植物進行觀察時一定要讓材料盡量展開。七、作業(yè)： 繪口腔上皮細胞示線粒體形態(tài)與分布 繪小麥或黃豆根尖細胞示液泡系形態(tài)與分布實驗九、DNA的細胞化學反應——Feulgen反應一、實驗目的：通過根尖壓片法，掌握Feulgen反應顯示DNA的基本原理和主要操作環(huán)節(jié)二、實驗原理：Feulgen反應是1924年由Feulgen和Rossenbeck開創(chuàng)的。這一反應的原理是：DNA在一定的溫度（60℃）下，被酸水解，打開嘌呤堿與脫氧核糖連接的鍵。在脫氧核糖的一端形成游離的醛基，醛基與Schiff試劑（脫色堿性品紅）結合，形成紫紅色化合物。所以，凡有DNA的部位，會呈現(xiàn)紫紅色陽性反應，可以作為定性研究DNA的一種簡便方法。三、實驗用品：（一）、藥品：Schiff試劑：稱1g堿性品紅，溶于200ml已煮沸的蒸餾水中（要漫漫加入，不可一下全部倒入），繼續(xù)煮沸5分鐘（攪動），然后使其冷卻至50℃，過濾于棕色磨口瓶中，加入20ml1N HCl（取比重為119的HCl 325ml，加蒸餾水至1000ml即成），繼續(xù)冷卻至25℃時加入1g偏亞硫酸鉀（KHSO3）或偏亞硫酸鈉（NaHSO3），將瓶塞蓋嚴，置于暗處24小時，溶液應為無色，可保持在14℃冰箱中備用。如果紅色不退可加入2g活性炭粉末，攪動數(shù)分鐘后靜置數(shù)小時，再過濾即可脫去紅色。1N HCl：(應將鹽酸緩緩加入水中)。45%醋酸亞硫酸水溶液：在200ml自來水中，加入10ml 10%的偏亞硫酸鈉（或偏亞硫酸鉀）溶液，或加入10ml 30%的偏重亞硫酸鈉溶液，再加入1N HCl 10ml即成，蓋緊瓶塞。此液要現(xiàn)配現(xiàn)用。Carnoy固定液：95%酒精3份，冰醋酸1份混合即可。50%酒精、30%酒精。5%三氯醋酸（二）、用具：顯微鏡、恒溫水浴鍋、鑷子、刀片、載玻片、蓋玻片、酒精燈、青霉素小瓶、吸水紙等四、實驗材料：大蒜、洋蔥或蠶豆根尖五、方法步驟：取051cm的根尖，在carnoy固定液中固定224小時。固定時以冰箱中進行為宜。取出固定材料，用50%酒精、30%酒精、蒸餾水各沖洗5分鐘，以除掉材料上的醋酸。準備兩張切片，其中一張作對照。水解：用1N的冷HCl過洗材料一次，然后放入溫度穩(wěn)定在60℃的1N HCl中，水解1014分鐘，取出材料后再用1N冷HCl過一次。染色：將水解后的材料放入Schiff試劑中染色1小時左右，此時根尖部分會出現(xiàn)紫紅色。用亞硫酸水漂洗三次，每次5分鐘，使細胞質的紫紅色退掉，再流水沖洗5—15分鐘，洗后的材料放入蒸餾水中。用45%的醋酸壓片。鏡檢。與對照裝片比較。對照切片的制做：進行Feulgen反應時, 一般要做一對照切片以便驗證反應結果。對照切片可用下面兩種方法制作：不經(jīng)水解直接放入schiff試劑內染色。 材料固定后用5%三氯醋酸于90℃處理15min，用蒸餾水沖洗，以后步驟同實驗組。六、注意事項：Feulgen反應的染色深淺與材料、水解時的溫度和時間都有關系。水解時間的長短要根據(jù)固定液和材料來進行選擇，時間太短則游離的醛基量少而染色不深，時間太長會因醛基進一步變成其它物質，染色也不深。水解時的溫度要嚴格控制。未經(jīng)水解的對照切片在schiff試劑中最多不要超過1 h ( h即可)，時間過長，試劑本身的酸性也會使DNA水解，從而出現(xiàn)假的正反應。 Schiff試劑的作用 ：Feulgen反應成功與否的一個非常關鍵的因素，就是schiff試劑的質量。有一大類試劑均稱為堿性品紅，它們實際上是由幾種產(chǎn)品分別組成的。因此只能選用注明“DNA染色反應用”的堿性品紅才行。此外，Schiff試劑的配制方法也可影響DNA的染色反應。七、作業(yè)：繪圖表示Feulgen反應的染色結果, 并驗交Feulgen反應的壓片1張。 總結Feulgen反應染色結果的影響因素。Feulgen反應的實驗原理是什么？ 在稀鹽酸水解后，為什么要用亞硫酸水洗片？實驗十、RNA的細胞化學反應——Unna反應一、實驗目的：掌握顯示細胞內RNA和DNA的主要細胞化學方法以及了解RNA和DNA在細胞內的一般分布狀況。二、實驗原理： 1989年Pappenheim首創(chuàng)了甲基綠派洛寧染色法。1902年Unna對這一方法進行了改良。1940年Brachet研究證明甲基綠和派洛寧對DNA和RNA有選擇性的染色效果。這是一種利用堿性染料顯示細胞內RNA的標準方法之一。其原理是：利用DNA