細(xì)胞生物學(xué)實驗匯總(編輯修改稿)
2025-04-19 12:04 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 室溫下發(fā)芽，待胚根長達(dá)12厘米時。預(yù)處理：將切下的根尖浸入1%的秋水仙素溶液中，室溫下處理34小時或0度低溫處理24小時。固定：取出根尖，投入Carnoy液固定半小時，冰箱中保存?zhèn)溆?。水解：將根尖用自來水漂?次，每次3分鐘，再加入1%纖維素酶和果膠酶混合酶液1ml，在37攝氏度恒溫水浴鍋中酶解6h.取出，吸干酶液，加蒸餾水，低滲30分鐘。取出，用吸管吸取34根根尖置于載玻片上，吸干水后搗碎，滴Carnoy液3滴涂開，酒精燈烤干。Giemsa液染色510分鐘。自來水沖洗，晾干后鏡檢。實驗七：DNA 的顯示——Feulgen 反應(yīng)【基本原理】Feulgen 反應(yīng)（Feulgen reaction）是顯示DNA 的最典型的組織化學(xué)反應(yīng)，為學(xué)者Feulgen 和Rossenbeck于1924 年發(fā)明，簡稱為Feulgen 法。因?qū)NA 的顯示反應(yīng)具有高度專一性，故常被用來顯示細(xì)胞內(nèi)DNA的分布情況。其具體反應(yīng)原理是，標(biāo)本經(jīng)稀鹽酸水解后，DNA 分子中的嘌呤堿基被解離，從而在核糖的一端出現(xiàn)了醛基。Schiff 試劑中的無色品紅可與醛基反應(yīng)，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基為發(fā)色團(tuán)，故可呈現(xiàn)出紫紅色。也就是說, DNA 經(jīng)稀酸水解后產(chǎn)生的醛基，具有還原作用，可與無色品紅結(jié)合形成紫紅色化合物，從而顯示出DNA 的分布。其反應(yīng)機制如下圖所示。2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3DNA經(jīng)溫稀酸水解，其上的嘌呤堿和脫氧核酸之間的鍵打開，使脫氧核糖的一端形成游離的醛基，這些醛基在原位與Schiff試劑中的無色品紅反應(yīng)，形成紫紅色的化合物， 因此Feulgen反應(yīng)中，顯示紫紅色的細(xì)胞部位，即標(biāo)志有DNA的存在。Feulgen反應(yīng)現(xiàn)仍廣泛用于DNA的定性定位和定量的顯微測定技術(shù)上?！緦嶒炗闷贰?．試劑 1）schiff 氏試劑 堿性品紅置入三角燒瓶內(nèi)沸騰的蒸餾水中，時時搖動玻璃瓶，煮沸5min 使之充分溶解，冷卻至50℃時過濾，加入10ml 1mol/L HCl，冷至25℃時， 偏重亞硫酸鈉（Na2S2O3）無水亞硫酸鈉（NaHSO3），在室溫冷暗處至少放置24h（有時需2~3 天），使其顏色退至淡黃色，密封瓶口，藏于暗處，最好保存于4℃冰箱中（可保存數(shù)月或更長時間）。 活性碳, 搖1min,用粗濾紙過濾，濾液應(yīng)為無色；若液體顏色變?yōu)榉奂t色，便不能再用。2）亞硫酸水（洗滌劑）：用200ml 普通自來水（不要用蒸餾水, 以免引起誤差）、10ml 10%的偏重亞硫酸鈉水溶液和10ml 1mol/L HCl，三者在使用前混合，現(xiàn)用現(xiàn)配。3）1mol/L HCl（水解用）： 的鹽酸加蒸餾水1000ml 即成（應(yīng)將鹽酸緩緩加入水中）。【方法步驟】 切取根尖或撕取表皮 ↓ Carnor固定劑 15min ↓ 70%酒精復(fù)水 5min 30%酒精復(fù)水 5min ↓ H20 ↙ ↘實驗組 對照組 → 5%三氯乙酸(TCA) ∣ 90℃保溫，15min ∣ ↙↓ H2o 5min ↙ 1mol/L Hcl 室溫 15min ↓ H2O漂洗 ↓ Schiff 試劑 4060min ↓ 亞硫酸水溶液沖洗三次（每次5分鐘） ↓ 自來水 ∣ 將染色后的根尖或表皮漂洗干凈。 ↓選效果好的材料壓片 水壓片 ↓ 鏡檢觀察【實驗結(jié)果】細(xì)胞核中的DNA 呈鮮亮的紫紅色反應(yīng)，它不但反應(yīng)出DNA 存在的部位及其分布情況，而且還可從顏色反應(yīng)的深淺，來判斷DNA 的相對含量。細(xì)胞質(zhì)DNA 也會出現(xiàn)陽性反應(yīng)。 附：Feulgen 方法應(yīng)注意的幾個問題：1．對照切片的制做：進(jìn)行Feulgen 反應(yīng)時, 一般要做一對照切片以便驗證反應(yīng)結(jié)果。對照切片應(yīng)不經(jīng)水解直接放在schiff 劑內(nèi)，且應(yīng)為負(fù)反應(yīng)。但需要注意的是，對照切片在schiff 試劑中最多不要超過1 h （ 即可)，時間過長，試劑本身的酸性也會使DNA 水解，從而出現(xiàn)假的正反應(yīng)。2．固定劑的選擇：以前很多人認(rèn)為，選用的固定劑不應(yīng)含有醛基或含有氧化劑。后來發(fā)現(xiàn)含醛基或氧化劑的固定劑對反應(yīng)的專一性并沒有影響。實踐證明，一切好的組織學(xué)固定劑均適用于Feulgen 反應(yīng)。如Bhampy 固定劑、Helly 固定劑、Flemming 固定劑、OsO4 固定劑、Carnoy 固定劑、zenker 固定劑和BouinAll
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