09級(jí)細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)-wenkub
2023-04-19 23:01:17 本頁(yè)面
【正文】 以維持細(xì)胞不死．但支持細(xì)胞生長(zhǎng)一般需加 10％血清．⑦對(duì)于血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對(duì)血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚．⑧血清中不僅存在促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，同對(duì)也存在細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。 （4） 無(wú)毒11. 選擇血清需注意事項(xiàng)有哪些？注意事項(xiàng)：①血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。⑶繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時(shí)間，縱坐標(biāo)為細(xì)胞濃度。9舉例說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的制作方法？⑴計(jì)算細(xì)胞濃度2次，得出細(xì)胞濃度平均值。此期一般持續(xù)1～4周。7原代培養(yǎng)的概念：取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng) 。（3）減少培養(yǎng)液中血清的含量，使培養(yǎng)液黏度降低。（3）機(jī)械，物理等因素（離心：促進(jìn)附著。（接觸抑制：當(dāng)一個(gè)貼壁生長(zhǎng)的體外正常細(xì)胞生長(zhǎng)至與另一個(gè)細(xì)胞的表面相互接觸時(shí)，便停止了分裂增殖，相互雖然緊密接觸，但不形成交叉重疊生長(zhǎng)，也不進(jìn)入S期。細(xì)胞株潛伏期一般為6～24小時(shí)。 5簡(jiǎn)述每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程分哪幾期？游離期 ： 細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮 狀態(tài)．也稱懸浮期此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。pH，Hela：太酸或太堿，成纖維細(xì)胞樣；標(biāo)準(zhǔn)pH，上皮樣細(xì)胞。來(lái)自同一個(gè)體的組織，分化低的比分化高的容易培養(yǎng)。細(xì)胞的粘附。細(xì)胞質(zhì)經(jīng)常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運(yùn)動(dòng)，．懸浮生長(zhǎng)型細(xì)胞概念：:來(lái)自血，脾或骨髓，尤以血中白細(xì) 胞多見(jiàn)，癌腫細(xì)胞也可能。扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核。2體外細(xì)胞的分化特點(diǎn)？細(xì)胞分化：在個(gè)體發(fā)育過(guò)程中，子代細(xì)胞產(chǎn)生形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能差異的過(guò)程。1細(xì)胞培養(yǎng)的概念？習(xí)慣上泛指所有的體外培養(yǎng)，即器官培養(yǎng)，組織培養(yǎng)，和細(xì)胞培養(yǎng)的總稱。（細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生化特征、生理功能為細(xì)胞分化的三項(xiàng)指標(biāo)），由于體外培養(yǎng)細(xì)胞失去了神經(jīng)、激素等體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞間相互影響，經(jīng)多次傳代增殖，久之則發(fā)生如下變化:分化現(xiàn)象逐漸減弱或不顯，形態(tài)與功能趨于單一化，或傳一定代數(shù)后衰老死亡；發(fā)生轉(zhuǎn)化，獲不死性而成為能無(wú)限傳代的連續(xù)細(xì)胞系或惡性細(xì)胞系。生長(zhǎng)特點(diǎn)：易相連成片，相靠—緊密相連—成薄層—鋪路石狀。特點(diǎn)：在懸浮液中生長(zhǎng)良好、細(xì)胞圓形，單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)。培養(yǎng)技術(shù)方法。培養(yǎng)條件：不同的細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基需求不同，當(dāng)前尚無(wú)一種培養(yǎng)基是萬(wàn)能的，應(yīng)選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基。細(xì)胞密度 3T3：低密度，成纖維細(xì)胞樣，高密度，上皮樣細(xì)胞。貼壁期：細(xì)胞附著于底物上，游離期 結(jié)束。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。密度抑制（density inhibition）：細(xì)胞數(shù)量到一定數(shù)量后引起抑制增殖的現(xiàn)象。流動(dòng)：培養(yǎng)液流動(dòng)可阻止細(xì)胞附著。（4）培養(yǎng)液中離子成分及其濃度。原代培養(yǎng)與體內(nèi)原組織很相似，具異質(zhì)性，相互依存性強(qiáng)，細(xì)胞克隆形成率低。⑵傳代期:細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長(zhǎng)一定時(shí)間后，被分開(kāi)接種到新的培養(yǎng)器皿中（不論稀釋與否）。然后，將細(xì)胞懸液等量加入培養(yǎng)板的每個(gè)孔中，培養(yǎng)時(shí)間7天。10. 體外培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件（1） 細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需要：氨基酸、單糖、維生素、無(wú)機(jī)離 子、微量元素、激素、生長(zhǎng)因子等。②常用血清有胎牛血清（剖腹產(chǎn)）、新生牛血清（小于24h）、小牛血清（10～30D）、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。12. 簡(jiǎn)述完全培養(yǎng)基的組成及配制方法?組成：基礎(chǔ)培養(yǎng)基80％一95％血清 5％一20％ g/L青、鏈霉素 各100單位／毫升. 配制方法:⑴認(rèn)真閱讀說(shuō)明書(shū)⑵配制時(shí)要保證充分溶解，各種物質(zhì)要在培養(yǎng)基完全溶解后添加⑶配制水應(yīng)為雙蒸水或三蒸水⑷所用器皿應(yīng)十分清潔⑸配制好后馬上過(guò)濾，低溫?zé)o菌保存。必要時(shí)用：2% NaOH浸泡過(guò)夜自來(lái)水充分沖洗 ，清潔液洗刷 5%鹽酸溶液浸泡30分鐘自來(lái)水和蒸餾水沖洗（15－20遍）晾干備用 ,紫外線直接照射或輻照滅菌15．無(wú)菌操作的注意事項(xiàng)？、PBS、培養(yǎng)基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％。防止交叉污染16. 分別指出下列物品通常使用那種消毒方法進(jìn)行消毒？（培養(yǎng)室、工作臺(tái)、玻璃制品、金屬器械、塑料制品，橡膠制品，培養(yǎng)用液、布類）.消毒方法分為三類： （A） 物理滅菌法（紫外線、濕熱、過(guò)濾等）。紫外線燈應(yīng)距地面 ，且消毒的物品不宜相互遮檔，照射不到的地方起不到消毒作用。3. 過(guò)濾消毒：將液體或氣體用微孔慮膜過(guò)濾,使大于孔徑的的細(xì)菌等微生物顆粒阻留, 壓滅菌的物品。后者則主要用器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒。如凈化工作臺(tái)使用過(guò)久，濾器受塵埃阻塞，可使凈化工作不能正常進(jìn)行。(2)器材：各種培養(yǎng)器皿及器械清洗消毒不徹底，例如洗刷不干凈．污物殘留及培養(yǎng)用液等滅菌不徹底都可以引入有害物質(zhì)。 (5）組織樣本：原代培養(yǎng)的污染多數(shù)來(lái)源于組織樣本；另一方面手術(shù)時(shí)使用碘酒消毒，這些混入組織中的碘可以影響細(xì)胞生長(zhǎng)。用濾器過(guò)濾除菌。（3）膠原酶：適于消化分離纖維性組織、上皮及癌組織，可使上皮細(xì)胞與膠原成分分離而不受損害。： 細(xì)胞株 密度抑制 接觸抑制 原代培養(yǎng) 傳代1細(xì)胞株（cell strain）：通過(guò)選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志的培養(yǎng)物稱細(xì)胞株。也稱再培養(yǎng)。22．凍存液的作用是什么？（1）保存種子細(xì)胞，以便隨時(shí)取用。（4）減少細(xì)胞因傳代培養(yǎng)而引起的遺傳變異和形態(tài)改變。23．為什么細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，細(xì)胞懸液逸出槽外時(shí)要重做？公式中除以4因?yàn)橛?jì)數(shù)了4個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)。于加藥后作用24~48小時(shí)，再換常規(guī)培養(yǎng)液。并可根據(jù)不同細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的不同耐受時(shí)間而分離和純化所需要的細(xì)胞。隨消化分離而脫落的組織塊也可一并傳入新的培養(yǎng)瓶。方式:：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后 再混勻傳代。％的胰蛋白酶液。原代培養(yǎng)，特別是正常細(xì)胞的培養(yǎng)，應(yīng)采用營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)液。28. 簡(jiǎn)述原代細(xì)胞培養(yǎng)方法及注意事項(xiàng)?常用的有兩種: 細(xì)胞培養(yǎng)法 和 組織塊法細(xì)胞培養(yǎng)法(1)按組織的消化分離法收獲細(xì)胞。組織塊法（1）取材、修剪、組織剪或切成1mm3左右的小塊。[注意事項(xiàng)]組織塊接種后l～3天，由于游出細(xì)胞數(shù)很少．組織塊的粘貼不牢固．在觀察相移動(dòng)過(guò)程中要注意動(dòng)作輕巧．盡量不要引起液體的振蕩而產(chǎn)生對(duì)組織塊的沖擊力使其漂起。注意事項(xiàng):1組織塊接種后l～3天，由于游出細(xì)胞數(shù)很少．組織塊的粘貼
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