【正文】 疫學于一體,培養(yǎng)細胞受支原體污染后，部分敏感細胞可見細胞生長增殖變慢，部分細胞變圓，從瓶壁脫落。開始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件下生存，對青霉素有抗藥性。3原代培養(yǎng)3—5d需換液一次．去除漂浮的組織塊和殘留的血細胞，因為已漂浮的組織塊及很多細胞碎片含有有毒物質(zhì)，影響原代細胞的生長，要及時清除。注意事項:1組織塊接種后l～3天，由于游出細胞數(shù)很少．組織塊的粘貼不牢固．在觀察相移動過程中要注意動作輕巧．盡量不要引起液體的振蕩而產(chǎn)生對組織塊的沖擊力使其漂起。 對原代培養(yǎng)要及時觀察．發(fā)現(xiàn)細胞游出后要照像記錄。[注意事項]組織塊接種后l～3天，由于游出細胞數(shù)很少．組織塊的粘貼不牢固．在觀察相移動過程中要注意動作輕巧．盡量不要引起液體的振蕩而產(chǎn)生對組織塊的沖擊力使其漂起。25ml培養(yǎng)瓶(）以20一30小塊為宜。組織塊法（1）取材、修剪、組織剪或切成1mm3左右的小塊。(3)已過濾的消化液，800一1000rpm，低速離心5min后，去除上清，加含血清培養(yǎng)液，輕輕吹打形成細胞懸液。28. 簡述原代細胞培養(yǎng)方法及注意事項?常用的有兩種: 細胞培養(yǎng)法 和 組織塊法細胞培養(yǎng)法(1)按組織的消化分離法收獲細胞。取材時應盡量選用易培養(yǎng)的組織進行培養(yǎng)。原代培養(yǎng)，特別是正常細胞的培養(yǎng)，應采用營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)液。取材時應嚴格無菌操作。％的胰蛋白酶液。2 .半懸浮生長細胞傳代（Hela細胞）此類細胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹 打法使細胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。方式:：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后 再混勻傳代。在傳代期培養(yǎng)時應注意：為保持二倍體細胞性質(zhì)，細胞應在傳代后早期凍存（不出10代內(nèi)凍存）。隨消化分離而脫落的組織塊也可一并傳入新的培養(yǎng)瓶。吹打細胞時動作要輕巧盡可能減少對細胞的損傷。并可根據(jù)不同細胞對胰蛋白酶的不同耐受時間而分離和純化所需要的細胞。另外將受支原體污染的細胞放置在41℃作用5—10h．最長不超過18h，以殺滅支原體．25. 培養(yǎng)細胞的生長測定方法1,細胞計數(shù)法2,臺盼蘭染色法3,MTT比色法4,細胞生長曲線法5,[3H]TdR([3H]胸腺嘧啶核苷）摻入法6,BrdU (5bromo2—deoxyuridine，5溴脫氧尿嘧啶核苷 ）摻入法26. 如何估計是否傳代及傳代的方式？估計:(1)細胞沒有生長到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前，不要急于傳代。于加藥后作用24~48小時，再換常規(guī)培養(yǎng)液。 公式中乘以104因為計數(shù)板中每一個大格的體積為： （長）（寬）（高）＝ 而 1ml＝1000mm3 24. 在細胞培養(yǎng)中如何防止污染？（1）使用抗生素清除細菌和真菌。23．為什么細胞計數(shù)時，細胞懸液逸出槽外時要重做？公式中除以4因為計數(shù)了4個大格的細胞數(shù)。（4）減少細胞因傳代培養(yǎng)而引起的遺傳變異和形態(tài)改變。（2）減少細胞被微生物污染的危險性。22．凍存液的作用是什么？（1）保存種子細胞，以便隨時取用。3如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反．結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。也稱再培養(yǎng)。4原代培養(yǎng)（primary culture）：從體內(nèi)取出細胞或組織的第一次培養(yǎng)。： 細胞株 密度抑制 接觸抑制 原代培養(yǎng) 傳代1細胞株（cell strain）：通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標志的培養(yǎng)物稱細胞株。但膠原酶價格較高，大量使用將增加實驗成本。（3）膠原酶：適于消化分離纖維性組織、上皮及癌組織，可使上皮細胞與膠原成分分離而不受損害。用含血清培養(yǎng)液終止其對細胞的消化作用 （1）EDTA液：常用濃度為 ％，配制時采用無Ca2+、Mg2+平衡鹽液溶解，高壓滅菌后即可使用。用濾器過濾除菌。胰蛋白酶液濃度越高，作用越強，但超過一定限度會損傷細胞。 (5）組織樣本：原代培養(yǎng)的污染多數(shù)來源于組織樣本；另一方面手術(shù)時使用碘酒消毒，這些混入組織中的碘可以影響細胞生長。培養(yǎng)兩種以上細胞時，操作不規(guī)范、交叉使用吸管或營養(yǎng)液瓶等有可能導致細胞交叉污染。(2)器材：各種培養(yǎng)器皿及器械清洗消毒不徹底，例如洗刷不干凈．污物殘留及培養(yǎng)用液等滅菌不徹底都可以引入有害物質(zhì)。污染空氣可侵入操作野，造成污染。如凈化工作臺使用過久，濾器受塵埃阻塞，可使凈化工作不能正常進行。17. 你認為細胞培養(yǎng)中微生物污染主要是通過那些途徑導致的，并簡要說明。后者則主要用器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒。4化學消毒法：利用消毒劑來消毒那些不能用物理方法消毒的物品和場地。3. 過濾消毒：將液體或氣體用微孔慮膜過濾,使大于孔徑的的細菌等微生物顆粒阻留, 壓滅菌的物品。2. 溫熱消毒：即高壓蒸氣消毒，是一種使用最廣泛、效果最好的消毒方法。紫外線燈應距地面 ，且消毒的物品不宜相互遮檔，照射不到的地方起不到消毒作用。 （ C） 抗生素。防止交叉污染16. 分別指出下列物品通常使用那種消毒方法進行消毒？（培養(yǎng)室、工作臺、玻璃制品、金屬器械、塑料制品，橡膠制品，培養(yǎng)用液、布類）.消毒方法分為三類： （A） 物理滅菌法（紫外線、濕熱、過濾等）。動作要輕、準確，不能亂碰。必要時用：2% NaOH浸泡過夜自來水充分沖洗 ，清潔液洗刷 5%鹽酸溶液浸泡30分鐘自來水和蒸餾水沖洗（15－20遍）晾干備用 ,紫外線直接照射或輻照滅菌15．無菌操作的注意事項？、PBS、培養(yǎng)基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％。如：培養(yǎng)液、各種酶類等。12. 簡述完全培養(yǎng)基的組成及配制方法?組成：基礎培養(yǎng)基80％一95％血清 5％一20％ g/L青、鏈霉素 各100單位／毫升. 配制方法:⑴認真閱讀說明書⑵配制時要保證充分溶解，各種物質(zhì)要在培養(yǎng)基完全溶解后添加⑶配制水應為雙蒸水或三蒸水⑷所用器皿應十分清潔⑸配制好后馬上過濾，低溫無菌保存。④血清的滅活（消除補體活性）：56 ℃ ，30 分鐘。②常用血清有胎牛血清（剖腹產(chǎn)）、新生牛血清（小于24h）、小牛血清（10～30D）、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。（3） 無污染。10. 體外培養(yǎng)細胞生長的條件（1） 細胞的營養(yǎng)需要：氨基酸、單糖、維生素、無機離 子、微量元素、激素、生長因子等