【正文】 ? 在堿性條件下 ,蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、色氨酸可與酚試劑中的 磷鉬鎢酸 發(fā)生反應(yīng) ,生成一種藍(lán)色的化合物 ,顏色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比 .此法是測定蛋白質(zhì)濃度的常用方法 . (六 ) 蛋白質(zhì)沉淀反應(yīng) 定義：蛋白質(zhì)在溶液中靠水化膜和電荷保持其穩(wěn)定性 ， 水化膜和電荷一旦除去 ， 蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性就被破壞 ， 蛋白質(zhì)就會從溶液中沉淀下來 ， 此現(xiàn)象即為 蛋白質(zhì)的沉淀作用 。 變性的蛋白質(zhì)容易沉淀，但沉淀的蛋白質(zhì)不一定變性。 ① 加高濃度的鹽：中性鹽（如硫酸銨）能使蛋白質(zhì)發(fā)生 可逆 沉淀。鹽析沉淀一般不引起變性。 ②加有機溶劑：乙醇、丙酮等能使蛋白質(zhì)沉淀。 ③加熱 :制豆腐 ④加重金屬鹽：重金屬鹽（如醋酸鉛）能使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆沉淀。 （牛奶解毒） ⑤加某些酸（生物堿試劑）：生物堿試劑能使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀。 蛋白質(zhì)的分離純化與測定 一、分離純化蛋白質(zhì)的意義 ? 研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能： 要求純度高 ， 不變性； ? 提取活性的酶或蛋白質(zhì)： 必須保持天然活性狀態(tài)； ? 作為藥物或食品添加劑： 純度要求一般。 二、蛋白質(zhì)分離純化的一般步驟 原料的預(yù)處理 → 粗分級分離 → 細(xì)分級分離 第六節(jié)、 蛋白質(zhì)的分離純化 ： 要求含待分離的蛋白質(zhì)豐富，廉價，易得，容易收集，新鮮無腐敗。 ： 要求把蛋白質(zhì)從原來的組織或細(xì)胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來 ,并保持原來的天然狀態(tài) ,不丟失生物活性 .為此動物材料應(yīng)先剔除結(jié)締組織和脂肪組織 ,種子材料應(yīng)先去殼去皮 ,然后選擇適當(dāng)?shù)姆椒?,將組織和細(xì)胞破碎以獲得蛋白質(zhì)抽提液 . ： 常用鹽析法、有機溶劑分級分離、等電點沉淀法。 ： 也就是樣品的進(jìn)一步純化 . 純化方法：電泳法、凝膠過濾法、離子交換層析、吸附層析法、親和層析等。 (一 )根據(jù)溶解度不同的分離方法 ? 影響蛋白質(zhì)溶解度的 外部因素 主要有 : ? ① 溶液的 PH值 ②離子強度 ? ③介電常數(shù) ④溫度 ? 內(nèi)部因素 : ? 如氨基酸的組成 ,極性基團(tuán)和非極性基團(tuán)的多少等 陰 極 陽 極 pH=pI pHpI pHpI 帶正電荷 帶負(fù)電荷 凈電荷為零 導(dǎo)電率 溶解度 滲透壓 粘度 達(dá)到最低 ? PH控制 原因 :在等電點時，蛋白質(zhì)分子以雙極離子存在，總凈電荷為零 ,顆粒無電荷間的排斥作用 ,易凝集成大顆粒，因而最不穩(wěn)定，溶解度最小，易沉淀析出。 電泳分離 沉淀分離 …… ? ? ①鹽離子電荷的中和作用，使蛋白質(zhì)溶解度下降； ? ②鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭奪水分子，降低了用于溶解蛋白質(zhì)的有效水量，減弱了蛋白質(zhì)的水合程度，破壞了蛋白表面的水化膜，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度下降； ? ３．低溫有機溶劑沉淀法 ? ① 破壞蛋白質(zhì)的水化膜 ? ②改變了介質(zhì)的介電常數(shù) ? ４．溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響 ? 在一定的溫度范圍內(nèi)，約０～４０ ℃ ，大部分球狀蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度的升高而升高（但ＨＢ例外），在４０ ℃ 以上，大多蛋白質(zhì)開始變性，因此蛋白質(zhì)的分離一般在０ ℃ 或更低溫度進(jìn)行 １．透析及超濾法 * 透析 (dialysis) 利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。 * 超濾法 利用正壓或離心力強行使水和小分子溶質(zhì)通過半透膜，而蛋白質(zhì)被截留在膜上，以達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。 （二）根據(jù)分子大小不同的分離純化方法 ２．層析 層析 (chromatography)分離蛋白質(zhì)的原理 待分離蛋白質(zhì)溶液（流動相）經(jīng)過一個固態(tài)物質(zhì)（固定相）時，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的 。 蛋白質(zhì)分離常用的層析方法 * 離子交換層析： 利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進(jìn)行分離。 ? 凝膠過濾 (gel filtration)又稱分子篩層析， 利用 各 蛋白質(zhì)分子大小不同分離。 目 錄 （三）根據(jù)電離性質(zhì)不同的分離純化方法 蛋白質(zhì)在高于或低于其 pI的溶液中為帶電的顆粒 ， 在電場中能向正極或負(fù)極移動 。 這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù) , 稱為 電泳 (elctrophoresis) 。 根據(jù)支撐物的不同 ， 可分為薄膜電泳 、 凝膠電泳等 。 幾種重要的蛋白質(zhì)電泳 *SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 ，常用于蛋白質(zhì)分子量的測定。 *等電聚焦電泳 ，通過蛋白質(zhì)等電點的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。 *雙向凝膠電泳 是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。 凝膠電泳法： （四）根據(jù)配基特異性的分離純化方法 ? 親和層析 是利用蛋白質(zhì)分子對其配體分子特有的識別能力，也即生物學(xué)親和力建立起來的一種有效的純化分離方法． ? 常用的生物親和關(guān)系有： 底物 。 激素 受體； 抗體。 ? ? 原理 ： 先把待提純的某一蛋白質(zhì)的特異 配基 ，通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng) 共價 的連接到像瓊脂糖凝膠一類的載體表面的 功能基上， 在配基與多糖基質(zhì)間遷入一個連接臂使配基于凝膠之間保持足夠的距離，不致因載體表面的空間位阻而妨礙待分離的大分子與其配基的結(jié)合。 三．蛋白質(zhì)的純度鑒定、含量測定和結(jié)構(gòu)分析 ? （一）蛋白質(zhì)純度的鑒定 ? １．層析法 ? ２．電泳法 ? ３．免疫化學(xué)法 ? (二 )蛋白質(zhì)的含量測定 ? １．克氏定氮法 (經(jīng)典 ) ? ２．福林－酚試劑法 ? ３．雙縮脲法 ? ４．紫外分光光度法 ? ５．ＢＣＡ比色法 ? ６．Ｂ radford蛋白分析法 本章小結(jié) ? 蛋白質(zhì)的生物學(xué)作用：功能蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白 ? Pr的組成（元素組成、化學(xué)組成）及含量的測定 ? 二十種 aa的結(jié)構(gòu)、分類及名稱（三字縮寫符） ? 氨基酸的重要理化性質(zhì)：兩性解離、茚三酮顯色 ? Pr的一級結(jié)構(gòu)：肽、肽鍵、活性多肽及一級結(jié)構(gòu)的測定 ? 蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)：二級結(jié)構(gòu)單元（ ?螺旋、 ?折疊、 ?轉(zhuǎn)角、無規(guī)則轉(zhuǎn)曲）、三級與四級結(jié)構(gòu)（超二級結(jié)構(gòu)、模體、結(jié)構(gòu)域、亞基）及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 ? 蛋白質(zhì)的性質(zhì)：大分子性質(zhì)、蛋白質(zhì)分子量的測定（離心法、凝膠過濾法、 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法）、兩性解離（等電點、電泳、離子交換）、膠體性質(zhì)、蛋白質(zhì)沉淀、蛋白質(zhì)變性 習(xí)題 ?在 280nm波長附近具有最大吸收峰的氨基酸是 A．谷氨酸 B．色氨酸 C．苯丙氨酸 D．組氨酸 E．賴氨酸 ?變性蛋白質(zhì)的主要特點是： A．粘度下降 B．溶解度增加 C．不易被蛋白酶水解 D．生物學(xué)活性喪失 E．容易被鹽析出現(xiàn)沉淀 ? 天然蛋白質(zhì)中不存在的氨基酸是 A、半胱氨酸 B、瓜氨酸 C、絲氨酸 D、色氨酸 E、丙氨酸 螺旋每上升一圈相當(dāng)于幾個氨基酸殘基 A、 B、 C、 D、 E、 Hb分子中氨基酸替換及位置是 A、 α 鏈第六位 GluVal B、 α 鏈第六位 ValGlu C、 β 鏈第六位 GluVal D、 β 鏈第六位 ValGlu E、以上都不是 A、溴化氰 B、 2,4二硝基氟苯 C、 β 巰基乙醇 D、三氯醋酸 E、碘乙酸 ? ? 使蛋白質(zhì)成為穩(wěn)定的親水膠體 ,有兩種因素 ,即＿＿＿＿＿和＿＿＿＿＿ ? 組成蛋白質(zhì)分子的堿性氨基酸有 ________、________和 ________；酸性氨基酸有 ________和________。 ? 谷胱甘肽是由 3種氨基酸通過肽鍵連接而成，這 3種氨基酸分別是 ________、 ________和 ________ ? 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)的類型有 ________、 ________、________和 ________ ? 問答：蛋白質(zhì)功能有哪些？