【正文】 將兩類抗原與抗體混合后，兩類抗原均能與抗體結(jié)合，當 Ag*和 Ab數(shù)量恒定，且 Ag*與 Ag之和大于 Ab上結(jié)合點數(shù)目時， Ag*與 Ag 存在競爭抑制： Ag數(shù)量增加， AbAb生成量增加， Ag*Ab數(shù)量就減少，游離的 Ag*就增多。 (3) 用層析等方法將 Ag*Ab和 AgAb復合物 (bind, B)與游離 Ag*和 Ag (free, F)分離，測定 B和 F的放射活性。計算 B/F值，繪制 B/F和 Ag量的關(guān)系曲線圖。 (4) 預先用一系列已知濃度的未標記抗原和一定量的標記抗原及抗體混合，以相同方法繪制B/F和 Ag量的關(guān)系的標準競爭抑制曲線圖。 (5) 試驗時，在同樣條件下，根據(jù)待測 Ag的放射性結(jié)合率，依標準曲線查出 Ag量。 免疫應用： 免疫學方法 （四）熒光和化學發(fā)光免疫技術(shù) A. 熒光免疫技術(shù) 1. 定義： 用熒光素（如異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明和四甲基異硫氰酸羅丹明）標記來檢測抗原抗體反應的免疫分析技術(shù)。 2. 種類： 包括熒光免疫組織化學 (如熒光抗體 )技術(shù)和熒光免疫測定。 B. 發(fā)光免疫分析 定義： 利用物質(zhì)的發(fā)光特征 (如輻射光波長、發(fā)光的光子數(shù) )與產(chǎn)生輻射的物質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)常數(shù)、構(gòu)型、數(shù)量等密切相關(guān)，通過受激分子發(fā)射的光譜，發(fā)光衰減常數(shù)、發(fā)光方向等來判斷該分子的屬性；通過發(fā)光強度來判斷物質(zhì)的量的免疫分析技術(shù)。 免疫應用： 免疫學方法 該技術(shù)是將發(fā)光分析（ 化學發(fā)光 和生物發(fā)光 ）和免疫反應相結(jié)合而建立的一種新型超微量分析技術(shù)。這種方法兼具有發(fā)光分析的高靈敏性和抗原抗體反應的高度特異性。 原理 ： （五）免疫電鏡技術(shù) 1. 定義： 在保持抗體免疫性的前提下，用高電子密度的標記物（如鐵蛋白、金等），或用經(jīng)細胞化學方法處理使電子密度增高的標記物（如辣根過氧化物酶等酶類）標記抗體后，將標記抗體與相應抗原結(jié)合，然后用電子顯微鏡觀察的技術(shù)。又稱電子顯微鏡免疫細胞化學技術(shù)。 2. 種類： (1) 非包埋法免疫染色： 該法是以超薄冷凍切片進行免疫染色。因該法不經(jīng)脫水和包埋等步驟，抗原保護較好，且有利于免疫試劑在組織中的滲透；但在技術(shù)上困難較多，需配制專用設(shè)備。 (2) 包埋前免疫染色： 組織固定 ? 厚切片 ?免疫染色 ?包埋 ?超薄切片? 投射電鏡觀察。 (3) 包埋后免疫染色： 組織固定 ? 包埋 ?超薄切片 ?免疫染色 ? EM觀察。 免疫應用： 免疫學方法 免疫應用： 免疫學原理的應用 第五節(jié) 免疫學原理在魚蝦病害防治中的應用 一、用于疾病的診斷 （免疫診斷方法有二類） ： 用已知抗原與從患病動物中提取的抗體進行血清學反應，以確定病原種類。該法只能用于病體已產(chǎn)生抗體的診斷。 ： 將已知抗體與從病體中分離的病原進行血清學反應，以確定病原的種類，該法適于所有被診斷動物。 診斷方法 特點 抗體檢測量 應用范圍 血清中和試驗 靈敏度高，費時 ≥103?g/ml 病毒病 沉淀反應 方便可靠，靈敏度低 ≥20 細菌病 補體結(jié)合試驗 靈敏度高，存在干擾 ≥101 細菌病 凝集反應 快速準確，應用局限 ≥3?102 部分細菌病 免疫熒光 快速方便，需特殊儀器 ≥20 細菌病 放射免疫測定 快速靈敏，需特殊儀器 ≥103 病毒病 ELISA 快速靈敏，應用前景好 ≥103 細菌病 二、用于疾病的治療 利用被動免疫，即給患病動物接種抗體進行應急治療。 過程： 先將抗原（疫苗）注入同種或其他種動物機體， 14周后從接種動物的血液等部位提取抗體（或制備卵黃抗體），并將提取的抗體接種到患病動物中進行疾病治療。 三、用于疾病的預防 ? 水產(chǎn)動物免疫最重要的應用方向為研制疫苗進行疾病的預防 ? 在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物中，由于只有魚類、兩棲類和爬行類等脊椎動物 才能在接種抗原后產(chǎn)生抗體，目前因此也認為只有這些動物才能用免疫學方法進行疾病的預防。 免疫： 免疫學原理的應用 （一）魚用疫苗的種類 A. 根據(jù)疫苗的獲得方法來分： 1. 死疫苗 (滅活疫苗 )： 熱滅活、化學滅活、紫外線滅活、超聲滅活等 優(yōu)點： 安全性好，制造簡單； 缺點： 免疫劑量大，免疫持久性差。 2. 活疫苗： 包括弱毒疫苗和異種疫苗 優(yōu)點： 弱毒（減毒）疫苗 — 免疫原性好，免疫劑量少，持續(xù)時間長 異種疫苗 — 安全性好，免疫時間長。 缺點： 弱毒（減毒）疫苗 — 安全性較差 異種疫苗 — 獲得比較困難 3. 化學疫苗： 以化學方法提取病菌有效成分 (如 LPS)制成 優(yōu)點： 免疫劑量小，免疫原性強，作用穩(wěn)定； 缺點： 制造較復雜，成本稍高。 免疫： 免疫學原理的應用 4. 亞單位疫苗： 病原微生物中能使機體產(chǎn)生免疫保護力的成分只占病原體小部分，將這些 成分分離 出來制成的疫苗為亞單位疫苗。 優(yōu)點： 可除去有害成分，減少異常反應，提高免疫效果； 缺點： 制造過程復雜、成本高。 5. 基因工程疫苗： 將病原的主要免疫原性蛋白的編碼基因 DNA 轉(zhuǎn)移、重組后獲得 優(yōu)點： 易于規(guī)模生產(chǎn)，成本低； 缺點： 研究周期長，免疫原成分單一，產(chǎn)生抗體量小。 6. 合成疫苗： 將具有保護性免疫力的人工合成肽與適當載體結(jié)合后，再加入佐劑制成的疫苗稱為合成疫苗 優(yōu)點： 作用效果好，易于規(guī)模生產(chǎn)； 缺點： 研究難度大。 免疫： 免疫學原理的應用 B. 根據(jù)疫苗的性質(zhì)和組成成分來分： 1. 單價疫苗： 由單一株型病菌培養(yǎng)制備的疫苗 2. 多價疫苗： 由同一種病菌的不同型或不同株培養(yǎng)制備的疫苗 3. 聯(lián)苗 (混合疫苗 )： 由一種以上的病菌或其代謝產(chǎn)物制備的疫苗 如：二聯(lián)疫苗、三聯(lián)疫苗 …… C. 根據(jù)抗原類別來分： 1. 病毒疫苗： 如草魚出血病疫苗 2. 細菌疫苗： 如石斑魚創(chuàng)傷弧菌疫苗 3. 寄生蟲疫苗： 如小瓜蟲疫苗 免疫： 免疫學原理的應用 （二）魚用疫苗的接種方法 1. 注射法： 將疫苗直接注射到肌肉、腹腔或心臟的免疫接種方法。 優(yōu)點： 免疫效果好； 缺點： 操作困難，易損傷接種魚類，幼魚無法使用 。 2. 口服法： 將疫苗通過投喂的方法接種到魚類機體 優(yōu)點： 操作簡單； 缺點： 免疫效果不穩(wěn)定（因消化液對疫苗的消化分解） 3. 浸泡法： 將魚類浸泡于疫苗溶液中以達到免疫接種目的 優(yōu)點： 操作簡單； 缺點： 免疫效果不穩(wěn)定（因浸泡進入機體的疫苗數(shù)量有限） 免疫： 免疫學原理的應用 4. 噴霧法： 將疫苗以高壓噴射到接種生物體表以進行免疫的方法。 優(yōu)點： 操作簡單； 缺點： 免疫效果差 。 5. 其他方法： 如超聲免疫法等，該法是在浸泡法基礎(chǔ)上外加超聲作用而實施的接種方法，目前尚在探索中。 （三）幾種常見魚類疫苗的制備方法 1. 病毒性疫苗（組織苗）的制備方法 勻漿 , 3000rpm,30min 上清液 +(800單位青霉素 +800單位鏈霉素 )/ml 病魚組織 +生理鹽水 沉淀 加 1‰ 福爾馬林， 32℃ 72h 安全檢測 冷凍保存 組織苗 效力檢測 免疫： 免疫學原理的應用 2. 細菌滅活疫苗的制備方法 擴大培養(yǎng) 5000rpm, 30min, PBS配制 病原菌 大量病菌 1%菌懸液 活菌檢測 安全檢測 410‰ 福爾馬林 毒性檢測 4℃ , 24h 疫苗 抗體效價檢測 免疫效果檢測 ‰ 疊氮鈉 攻毒試驗 4℃ 保存 免疫： 免疫學原理的應用 3. 脂多糖 (LPS)疫苗的制備 (主要針對 G) %formalin, 上清液 加 PBS 病菌擴大培養(yǎng) 5000rpm, 30min 沉淀 滅活菌懸液 4℃ , 透析 3d 90%苯酚 (1:1) LPS水溶液 水層 65℃ , 10min 聚乙二醇 2022 中間層 混合液 苯酚層 10000rpm, 30min 濃縮 LPS溶液 冷凍干燥 粗制 LPS LPS疫苗 PBS溶解，加熱去毒 免疫： 免疫學原理的應用 （四）魚類免疫應答的過程 1. 硬骨魚類參與免疫應答的細胞和器官 1) 參與免疫反應的細胞： 巨噬細胞、淋巴細胞、漿細胞 2) 參與免疫反應的器官： 胸腺、腎 (主要為頭腎 )、脾等。 2. 魚類免疫應答的基本過程 識別 吞噬或胞飲，送至 抗原進入機體 巨噬細胞 脾和腎等器官 吸收積累 產(chǎn)生 細胞免疫和體液免疫 淋巴細胞 抗原信息 增殖、產(chǎn)生 傳遞 免疫： 免疫學原理的應用 3. 影響魚類免疫應答的因素 1) 抗原方面的因素： 包括疫苗性質(zhì)、接種數(shù)量和接種方法等 2) 接種生物的因素： 包括年齡、大小、生理狀態(tài)、營養(yǎng)狀況等 3) 環(huán)境因素： 包括溫度、季節(jié)、光照及水質(zhì)環(huán)境因素等 4) 佐劑的影響： 有些佐劑能非特異性增強或改變疫苗免疫應答效果。 （五）魚類免疫效果的檢測方法 1. 免疫保護效果檢測： 接種疫苗 ?(24周 )致病菌攻毒 ?(1020d)成活率 2.