【正文】 其作用與 IgG類似，具有殺菌、溶菌、調(diào)理吞噬及凝集作用等，不過，由于 IgM抗原結(jié)合效價(jià)最高，是高效能的抗菌抗體，它的上述作用均比IgG強(qiáng)。前者 85%為單體，少數(shù)為含 J鏈的二聚體，主要由腸系膜淋巴組織漿細(xì)胞產(chǎn)生；后者為二聚體 (雙體 )。 (3) 是少數(shù)在消化道中不被消化的 Pr之一； (4) 嬰兒出生 46個(gè)月后才能合成，但可從母乳中獲得 SIgA (5) SIgA主要分布于呼吸道、消化道、泌尿生殖道粘膜表面以及唾液、淚液、初乳和與粘膜相關(guān)的分泌液中，是局部粘膜防御感染的重要因素； (6) 血清型 IgA具有中和毒素、調(diào)理吞噬的作用。 (2) 結(jié)構(gòu)與 IgG類似，不能通過胎盤，也不能激活補(bǔ)體。 免疫： 特異性免疫 第四節(jié) 免疫學(xué)方法及其應(yīng)用 一、基本概念 1. 血清學(xué)反應(yīng)： 抗原與相應(yīng)抗體在 體外 發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng) 。 3. 抗原抗體反應(yīng)： 抗原與相應(yīng)抗體在體外或體內(nèi)發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)； 4. 免疫診斷學(xué)： 用體液免疫或 /和細(xì)胞免疫的方法來診斷有關(guān)疾病的科學(xué)。 可逆性是 免疫吸附層析法 提取免疫純抗原或抗體的理論基礎(chǔ)。 4. 階段性 : 抗原抗體反應(yīng)具有明顯的階段性 1) 抗原抗體的特異性 結(jié)合階段 ： 時(shí)間短（數(shù)秒），不可見 2) 抗原與抗體反應(yīng)的 可見階段 ： 慢（數(shù)分至數(shù)天），有凝集、沉淀等 5. 高度敏感性： 可用于檢測(cè)極微量的抗原與抗體。 免疫： 免疫學(xué)方法及其應(yīng)用 三、主要的抗原抗體反應(yīng) （一）凝集反應(yīng)（ Agglutination） 1. 定義： 顆粒性抗原 (如完整的紅細(xì)胞或細(xì)菌 )與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下，經(jīng)過一定時(shí)間形成肉眼可見的凝集物，稱為凝集反應(yīng)。 玻片法： 屬定性試驗(yàn)，常用于細(xì)菌和 ABO血型鑒定 試管法： 屬定量試驗(yàn)，用已知 Ag測(cè)定血清中相應(yīng) Ab及其數(shù)量。 免疫應(yīng)用： 免疫學(xué)方法 (2) 間接凝集反應(yīng) (indirect or passive agglutination) ： 將可溶性抗原先吸附于一種與免疫無關(guān)的載體顆粒表面，再與相應(yīng)抗體作用，在合適電解質(zhì)存在時(shí)，出現(xiàn)載體顆粒被動(dòng)凝集現(xiàn)象。 免疫應(yīng)用： 免疫學(xué)方法 （二）沉淀反應(yīng) (precipitation) 1. 定義： 可溶性抗原 (如血清蛋白、多糖和細(xì)菌抽提液等 )與其相應(yīng)抗體在合適條件下出現(xiàn)肉眼可見沉淀物的現(xiàn)象。其中，前兩者敏感性不高，已少用，派生方法現(xiàn)仍廣泛應(yīng)用。因 沉淀環(huán)直徑與抗原濃度成正比 ，因此，若先用已知濃度的抗原制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，便可依沉淀環(huán)直徑測(cè)定待測(cè)抗原濃度。若反應(yīng)中有兩種或兩種以上抗原抗體系統(tǒng)，在瓊脂中即可出現(xiàn)兩條或兩條以上的沉淀線。缺點(diǎn)是所需時(shí)間較長(zhǎng)和靈敏度不高。 抗體等電點(diǎn)較抗原高 ，在此緩沖液中帶陰離子少，分子量大，泳動(dòng)較慢，同時(shí)因電滲作用（電滲是電場(chǎng)中溶液對(duì)于固體的相對(duì)移動(dòng)，瓊脂是酸性物質(zhì)含有較多的硫酸根，在堿性緩沖液中帶負(fù)電，而與它接觸的溶液帶正電，因此液體向陰極移動(dòng)，產(chǎn)生電滲），反而向陰極泳動(dòng)，這樣就使抗原、抗體在電場(chǎng)中相對(duì)移動(dòng)，而形成對(duì)流。由于電場(chǎng)作用，限制了抗原和抗體多方向的自由擴(kuò)散，加速了泳動(dòng)的速度，縮短了反應(yīng)時(shí)間，提高了靈敏度。 免疫應(yīng)用： 免疫學(xué)方法 （三）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn) 1. 定義： 有補(bǔ)體參與，以綿羊紅細(xì)胞和溶血素作指示系統(tǒng)的抗原抗體反應(yīng) 2. 組成： 有 2個(gè)系統(tǒng)共 5種成分 1) 檢測(cè)系統(tǒng)： 包括已知抗原 (或抗體 )和待測(cè)抗體 (或抗原 ) 2) 指示系統(tǒng)： 包括綿羊紅細(xì)胞和溶血素 (綿羊紅細(xì)胞的特異性抗體 ) 3) 補(bǔ)體： 取自豚鼠的新鮮血清 3. 補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)的基本原理 1) 補(bǔ)體可與任何抗原抗體復(fù)合物相結(jié)合； 2) 指示系統(tǒng)遇補(bǔ)體后就出現(xiàn)明顯的溶血反應(yīng) 免疫應(yīng)用： 免疫學(xué)方法 4. 操作過程和結(jié)果 1) 陽性反應(yīng) ： + 補(bǔ)體 抗原 (體 )+待測(cè)抗體 (原 ) ?抗原抗體復(fù)合物 抗原抗體和補(bǔ)體復(fù)合物 + 指示系統(tǒng) (綿羊紅細(xì)胞和溶血素復(fù)合物 ) 結(jié)果：（因此時(shí)無游離的補(bǔ)體與指示系統(tǒng)結(jié)合） 不發(fā)生溶血 2) 陰性反應(yīng) ： + 補(bǔ)體 抗原 (體 )+待測(cè)抗體 (原 ) ?抗原 +抗體 抗原 +抗體 +補(bǔ)體 (游離 ) + 指示系統(tǒng) (綿羊紅細(xì)胞和溶血素復(fù)合物 ) 發(fā)生溶血 綿羊紅細(xì)胞、溶血素及補(bǔ)體復(fù)合物 3）作用： 用于檢測(cè)血清中抗體的存在與否？ 免疫應(yīng)用： 免疫學(xué)方法 （四） 中和反應(yīng) 定義： 特異性抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合后，能抑制抗原的多種生物學(xué)活性（ 如：毒性、酶活性和病毒感染性等 ）的反應(yīng)。 ? : 抗毒素與外毒素結(jié)合后使外毒素性消失的試驗(yàn)。該試驗(yàn)也可用于抗毒效價(jià)的測(cè)定。 免疫標(biāo)記技術(shù)敏感性高、特異性強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣 (抗原或抗體定量、定性、定位 ) （一）免疫熒光技術(shù)（ immunofluorecence technique） 1. 定義： 用熒光物標(biāo)記抗體來檢測(cè)細(xì)胞或組織中相應(yīng)抗原或抗體的技術(shù)，又稱熒光抗體技術(shù)。 (1) 過程： +待測(cè)抗原 熒光素 +抗體 ? 熒光抗體 (一段時(shí)間后沖洗 ) 熒光鏡檢測(cè)結(jié)果： (2) 結(jié)果： 陽性 — 可見帶熒光的抗原抗體復(fù)合物； 陰性 — 無熒光 (因?yàn)閹晒獾目贵w不能與抗原結(jié)合，被沖洗掉 ) (3) 用途： 用以檢測(cè)病毒感染細(xì)胞、細(xì)菌和沉積于組織中的免疫復(fù)合物等。 免疫應(yīng)用： 免疫學(xué)方法 (二 )免疫酶技術(shù) (immunoenzymatic technique) or 酶免疫測(cè)定 1. 定義： 用酶標(biāo)記抗體或抗原來檢測(cè)抗原或抗體的方法 .應(yīng)用范圍極廣。 以 酶標(biāo)儀 作定量或定性分析。 4. 底物： 鄰苯二胺和對(duì)硝基苯磷酸酯。 6. 常用方法： 目前應(yīng)用最多的為 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) （ enzyme linked immusorbent assay, ELISA) ：是利用抗原或抗體能非特異性吸附于聚苯乙烯等固相載體表面的特性，使抗原 抗體反應(yīng)在固相載體表面進(jìn)行的一種免疫酶技術(shù)。 免疫應(yīng)用： 免疫學(xué)方法 例 1. 直接法 ： 用于檢測(cè)抗原或抗體 （特別是總抗體濃度） a. 用于檢測(cè)抗原時(shí)： 以不同稀釋度的待測(cè)樣品 (Ag)包被酶標(biāo)板反應(yīng)板，孵育后洗滌 ?封閉酶標(biāo)板，孵育后洗滌 ?加入酶標(biāo)抗體，孵育后洗滌 ?加入底物，測(cè)定酶促反應(yīng)強(qiáng)度。 免疫應(yīng)用： 免疫學(xué)方法 例 2. 雙抗體夾心法 ： 主要用于測(cè)定大分子抗原 過程： 以純化的特異性抗體或含抗體的血清包被酶標(biāo)反應(yīng)板，孵育后洗滌?封閉液封閉酶標(biāo)板，孵育后洗滌 ?加入待測(cè)樣品，孵育后洗滌 ?加入酶標(biāo)抗體，孵育后洗滌 ?加入酶底物，測(cè)定酶促反應(yīng)強(qiáng)度。主要用于求抗原的量。 (3) 用層析等方法將 Ag*Ab和 AgAb復(fù)合物 (bind, B)與游離 Ag*和 Ag (free, F)分離，測(cè)定 B和 F的放射活性。 (4) 預(yù)先用一系列已知濃度的未標(biāo)記抗原和一定量的標(biāo)記抗原及抗體混合，以相同方法繪制B/F和 Ag量的關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線圖。 免疫應(yīng)用： 免疫學(xué)方法 （四）熒光和化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù) A. 熒光免疫技術(shù) 1. 定義： 用熒光素（如異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明和四甲基異硫氰酸羅丹明）標(biāo)記來檢測(cè)抗原抗體反應(yīng)的免疫分析技術(shù)。 B. 發(fā)光免疫分析 定義： 利用物質(zhì)的發(fā)光特征 (如輻射光波長(zhǎng)、發(fā)光的光子數(shù) )與產(chǎn)生輻射的物質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)常數(shù)、構(gòu)型、數(shù)量等密切相關(guān)，通過受激分子發(fā)射的光譜，發(fā)光衰減常數(shù)、發(fā)光方向等來判斷該分子的屬性；通過發(fā)光強(qiáng)度來判斷物質(zhì)的量的免疫分析技術(shù)。這種方法兼具有發(fā)光分析的高靈敏性和抗原抗體反應(yīng)的高度特異性。又稱電子顯微鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。因該法不經(jīng)脫水和包埋等步驟，抗原保護(hù)較好，且有利于免疫試劑在組織中的滲透；但在技術(shù)上困難較多，需配制專用設(shè)備。 (3) 包埋后免疫染色： 組織固定 ? 包埋 ?超薄切片 ?免疫染色 ? EM觀察。該法只能用于病體已產(chǎn)生抗體的診斷。 診斷方法 特點(diǎn) 抗體檢測(cè)量 應(yīng)用范圍 血清中和試驗(yàn) 靈敏度高，費(fèi)時(shí) ≥103?g/ml 病毒病 沉淀反應(yīng) 方便可靠，靈敏度低 ≥20 細(xì)菌病 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn) 靈敏度高，存在干擾 ≥101 細(xì)菌病 凝集反應(yīng) 快速準(zhǔn)確，應(yīng)用局限 ≥3?102 部分細(xì)菌病 免疫熒光 快速方便，需特殊儀器 ≥20 細(xì)菌病 放射免疫測(cè)定 快速靈敏，需特殊儀器 ≥103 病毒病 ELISA 快速靈敏，應(yīng)用前景好 ≥103 細(xì)菌病 二、用于疾病的治療 利用被動(dòng)免疫，即給患病動(dòng)物接種抗體進(jìn)行應(yīng)急治療。 三、用于疾病的預(yù)防 ? 水產(chǎn)動(dòng)物免疫最重要的應(yīng)用方向?yàn)檠兄埔呙邕M(jìn)行疾病的預(yù)防 ? 在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物中，由于只有魚類、兩棲類和爬行類等脊椎動(dòng)物 才能在接種抗原后產(chǎn)生抗體，目前因此也認(rèn)為只有這些動(dòng)物才能用免疫學(xué)方法進(jìn)行疾病的預(yù)防。 2. 活疫苗： 包括弱毒疫苗和異種疫苗 優(yōu)點(diǎn)： 弱毒（減毒）疫苗 — 免疫原性好，免疫劑量少，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng) 異種疫苗 — 安全性好，免疫時(shí)間長(zhǎng)。 免疫： 免疫學(xué)原理的應(yīng)用 4. 亞單位疫苗： 病原微生物中能使機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)力的成分只占病原體小部分，將這些 成分分離 出來制成的疫苗為亞單位疫苗。 5. 基因工程疫苗： 將病原的主要免疫原性蛋白的編碼基因 DNA 轉(zhuǎn)移、重組后獲得 優(yōu)點(diǎn)： 易于規(guī)模生產(chǎn)，成本低； 缺點(diǎn)： 研究周期長(zhǎng)，免疫原成分單一，產(chǎn)生抗體量小。 免疫： 免疫學(xué)原理的應(yīng)用 B. 根據(jù)疫苗的性質(zhì)和組成成分來分： 1. 單價(jià)疫苗： 由單一株型病菌培養(yǎng)制備的疫苗 2. 多價(jià)疫苗： 由同一種病菌的不同型或不同株培養(yǎng)制備的疫苗 3. 聯(lián)苗 (混合疫苗 )： 由一種以上的病菌或其代謝產(chǎn)物制備的疫苗 如：二聯(lián)疫苗、三聯(lián)疫苗 …… C. 根據(jù)抗原類別來分： 1. 病毒疫苗： 如草魚出血病疫苗 2. 細(xì)菌疫苗： 如石斑魚創(chuàng)傷弧菌疫苗 3. 寄生蟲疫苗： 如小瓜蟲疫苗 免疫： 免疫學(xué)原理的應(yīng)用 （二）魚用疫苗的接種方法 1. 注射法： 將疫苗直接注射到肌肉、腹腔或心臟的免疫接種方法。 2. 口服法： 將疫苗通過投喂的方法接種到魚類機(jī)體 優(yōu)點(diǎn)： 操作簡(jiǎn)單； 缺點(diǎn)： 免疫效果不穩(wěn)定（因消化液對(duì)疫苗的消化分解） 3. 浸泡法： 將魚類浸泡于疫苗溶液中以達(dá)到免疫接種目的 優(yōu)點(diǎn)： 操作簡(jiǎn)單； 缺點(diǎn)： 免疫效果不穩(wěn)定（因浸泡進(jìn)入機(jī)體的疫苗數(shù)量有限） 免疫： 免疫學(xué)原理的應(yīng)用 4. 噴霧法： 將疫苗以高壓噴射到接種生物體表以進(jìn)行免疫的方法。 5. 其他方法： 如超聲免疫法等，該法是在浸泡法基礎(chǔ)上外加超聲作用而實(shí)施的接種方法，目前尚在探索中。 2. 魚類免疫應(yīng)答的基本過程 識(shí)別 吞噬或胞飲，送至 抗原進(jìn)入機(jī)體 巨噬細(xì)胞 脾和腎等器官 吸收積累 產(chǎn)生 細(xì)胞免疫和體液免疫 淋巴細(xì)胞 抗原信息 增殖、產(chǎn)生 傳遞 免疫： 免疫學(xué)原理的應(yīng)用 3. 影響魚類免疫應(yīng)答的因素 1) 抗原方面的因素： 包括疫苗性質(zhì)、接種數(shù)量和接種方法等 2) 接種生物的因素： 包括年齡、大小、生理狀態(tài)、營(yíng)養(yǎng)狀況等 3) 環(huán)境因素： 包括溫度、季節(jié)、光照及水質(zhì)環(huán)境因素等 4) 佐劑的影響： 有些佐劑能非特異性增強(qiáng)或改變疫苗免疫