【導(dǎo)讀】濕熱滅菌程序的驗(yàn)證：滅菌程序的設(shè)計(jì)、開發(fā)、確認(rèn)以及日?？刂?

　　

【正文】 在半對數(shù)曲線上將結(jié)果以存活數(shù)對滅菌時(shí)間（等效暴熱時(shí)間）作圖，再根據(jù)曲線的斜率確定 DT。 DT 值即是最佳數(shù)據(jù)點(diǎn)所組成直線的負(fù)倒數(shù)。必要時(shí)，可通過線性回歸分析，來確定最佳曲線的斜率。 微生物殘存曲線示例 用圖 的數(shù)據(jù)，可得到以下生物指示劑（ BI）殘存曲線的等式： Lg NF = F(T,z)/DT＋ Lg N0 Lg NF = F/＋ Lg106 還可用此等式來計(jì)算滅菌 F 分鐘后，預(yù)計(jì)的孢子數(shù) NF 。如果滅菌時(shí)間的物理參數(shù)是 30 分 鐘， NF 為 106 ，也就是說，滅菌 30 分鐘后，孢子存活的概率為一百萬分之一，計(jì)算式如 下： Lg NF = F/+ Lg106 Lg NF = 30/+ Lg106 Lg NF = 12+6 Lg NF = 6 NF = 106 也可將此等式重排，根據(jù)滅菌后生物指示劑的測得的殘存數(shù)來計(jì)算滅菌時(shí)間 F（殺滅時(shí)間） F = （ Lg N0LgNF） DT F = （ Lg 106 Lg210 3 ） 分鐘 F = （ ） F = 分鐘 陰性分?jǐn)?shù)法 陰性分?jǐn)?shù)法采用 N0 及額定滅菌時(shí)間范圍中的一個(gè)點(diǎn)組成一條線，由此確定 DT 值。額定 滅菌時(shí)間范圍是指在滅菌的某個(gè)時(shí)間區(qū)域內(nèi)，一組平行的試樣會呈現(xiàn)兩種結(jié)果的區(qū)域，即一 些為陽性結(jié)果，另一些為陰性結(jié)果。有兩個(gè)主要的方法可用以分析陰性分?jǐn)?shù)法的數(shù)據(jù)，以確 定殘存曲線二點(diǎn)的 NF 值： y HolbSpearmanKarber 法。在此方法中，將額定滅菌時(shí)間范圍所有的數(shù)據(jù)通過 加權(quán)平均法合并起來，得到與每個(gè)生物指示劑 NF 平均存活數(shù)為 相對應(yīng)的平均 時(shí)間（ 11， 12， 13） y StumboMurphyCochran 法 （ 14） 。 此法要用 HalvorsonZiegler 的最大可能數(shù)法 （ 15） 對額定滅菌時(shí)間區(qū)域中的每個(gè)數(shù)據(jù)逐個(gè)分析，來確定每一組數(shù)據(jù)的 NF，然后確定 DT 值。再對這些 DT 值求平均值，以確定測試的 DT 值。 HolbSpearmanKarber 法能夠計(jì)算 DT 值可信度的范圍， 供評估試驗(yàn)數(shù)據(jù)的質(zhì)量和可 靠性參考。 需要特別注意的是，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算 DT 值時(shí)，需嚴(yán)格遵循統(tǒng)計(jì)分析的規(guī)則。試驗(yàn) 中采用的生物指示劑應(yīng)是平行試樣，且必須來自同一生物指示劑的批號。如果是企業(yè)自己制 備試樣，則試樣應(yīng)該取自同一批生物指示劑的懸浮液，且制備方式完全相同。試驗(yàn)中的培養(yǎng) 計(jì)數(shù)步驟應(yīng)完全一致。唯一的變量只是蒸汽滅菌的時(shí)間。 此外，對每組某一滅菌時(shí)間平行試驗(yàn)的樣品而言，試驗(yàn)必須保證每個(gè)試樣的滅菌時(shí)間相 似。通常用耐 熱性測試儀在實(shí)驗(yàn)室中完成此試驗(yàn)。當(dāng)樣品不是實(shí)際的平行試樣時(shí)，不宜采用 這類測試方法。例如，當(dāng)生物指示劑分布在整個(gè)滅菌腔室時(shí)，不應(yīng)當(dāng)用這些方法來評價(jià)生產(chǎn) 用滅菌器中 BI 的殺滅情況。在此種情況下，因整個(gè)滅菌器中滅菌率的均一性難以保證，因 此，不能將這些生物指示劑試樣看成平行樣品。 在 DT 值測試中，保證每個(gè)滅菌試驗(yàn)條件的一致性是至關(guān)重要的。一個(gè)正常運(yùn)行的耐熱 性測試儀是實(shí)現(xiàn)一致性理想的機(jī)械裝置，因?yàn)樗梢援a(chǎn)生近似于脈沖的方形波，加熱和冷卻 時(shí)間極短（見圖 ） 。 在以下情況 下，通常有必要測試 DT 值： y 按產(chǎn)品特性設(shè)計(jì)滅菌程序需要確定產(chǎn)品分離菌的耐熱特性時(shí) （產(chǎn)品分離菌通過熱休 克 8 獲得） ； y 評價(jià)處方變更對耐熱性的影響時(shí)； y 在常規(guī)生產(chǎn)中，需要確定從生產(chǎn)環(huán)境分離出耐熱菌的耐熱特性時(shí)； y 當(dāng)需要確定作為生物指示劑用的直接接種到物料或產(chǎn)品中的耐熱孢子的 D 值時(shí)。 溫度系數(shù)（ z 值） 孢子耐熱性隨溫度變化而變化的特性可用 z 來表示。 z 值是 DT 值變更一個(gè)對數(shù)單位時(shí)， 溫度需調(diào)節(jié)的度數(shù)。它類似于半對數(shù)模式中的溫度系數(shù)。在比較不同 溫度下對孢子的滅菌率 時(shí)，需要用 z 來計(jì)算 F 值。 例如， 生物指示劑挑戰(zhàn)系統(tǒng)的 z=8℃， 即溫度每變化 8℃， DT 值將會改變一個(gè)對數(shù)單位。 如果生物指示劑挑戰(zhàn)系統(tǒng)的 D121℃為 分鐘， 那么 D129℃即為 分鐘， D113℃為 分鐘。 溫差的正確測量單位是開氏溫度， 在任何情況下， 開氏 （ Kelvin） 溫度變化 1℃與攝氏 （ Celsius） 溫度變化 1℃是完全一致的。為了簡化起見，本文將全文采用攝氏溫度。 濕熱滅菌通?？傇O(shè)定在一個(gè)小的溫度范圍以內(nèi)，例如 110135℃之間，因此，在實(shí)際使 用中， 通常將經(jīng)驗(yàn)測試值 z 看作一個(gè)常量 （ 16） 。 常規(guī)滅菌程序設(shè)計(jì)和評估中 z 取 10℃或 18176。 F。 在對比平衡滅菌賦予產(chǎn)品的物理殺滅時(shí)間和生物殺滅時(shí)間 F 值的試驗(yàn)中，必須使用實(shí)際的 生物指示劑的 z 值來計(jì)算物理殺滅時(shí)間 FT。 z 值可由幾種方法確定；然而，采用得最多的方法還是通過 D 值的測試來確定 z 值。在 不同溫度下測得一組 D 值，取對數(shù)，然后以 y 軸為 D， x 軸為溫度作圖。將數(shù)據(jù)點(diǎn)連成一 條直線。 z 值是 D 值改變一個(gè)對數(shù)單位所對應(yīng)溫度變化 的度數(shù)，例如由 分鐘變?yōu)? 分 鐘，或者由 分鐘變?yōu)? 分鐘。與 D 值類似， z 值是此直線斜率的負(fù)倒數(shù)，參見耐熱性 曲線（圖 ） 。 （ 17）在應(yīng)用 z 值時(shí)，要根據(jù)預(yù)期的用途，采用攝氏溫度（開氏）或華氏 溫度（ Fahrenheit）來表述，并考慮好溫度的數(shù)值范圍。 滅菌率（ Lethal Rate）和累計(jì)殺滅時(shí)間（ lethality， F） 9 在濕熱滅菌中，所有生物學(xué)的測量，無非是將參照溫度下（ Tref）的等效滅菌時(shí)間與該 溫度下對微生物的 殺滅時(shí)間相關(guān)聯(lián)。采用 z 來計(jì)算滅菌率，測試時(shí)間 溫度并將獲得的數(shù)據(jù) 累計(jì)，這樣也就獲得了滅菌工藝的模式。 各種滅菌器是設(shè)定在特定溫度下運(yùn)行的，然而，實(shí)際溫度可能會在目標(biāo)值上下一定的范 圍內(nèi)波動(dòng)。這個(gè)波動(dòng)有時(shí)可能并不體現(xiàn)在滅菌程序的記錄上，它取決于記錄設(shè)備的精密度和 靈敏度。盡管這個(gè)波動(dòng)通常不大，但對 F 值的可能會有明顯的影響，尤其是滅菌溫度大部 偏在目標(biāo)值的一側(cè)時(shí)，影響更為明顯。 F 值的計(jì)算考慮了所有偏離目標(biāo)溫度的波動(dòng)情況，以 減少單個(gè)溫度觀察值對殺滅時(shí)間（ delivered lethality， 總等效滅菌時(shí)間）的影響。殺滅時(shí)間 是滅菌程序中滅菌率的累計(jì)值（積分值） 。 滅菌率（ L， Lethal Rate） 為了理解如何確定一個(gè)滅菌程序的殺滅時(shí)間（ F 值） ，有必要首先理解滅菌率（ L） 。滅 菌率可以通過以下等式計(jì)算得到： （ 18， 19， 20） L(Tref,z)=10(TTref)/z [等式 2] 式中： T = 被加熱的物體的實(shí)際溫度 Tref = 參照溫度 z = 試驗(yàn)生物指示劑的 z 值（如未知，則取 10℃） 滅菌率是一個(gè)指數(shù)函數(shù)，因此，很小的溫度變化就會對滅菌率產(chǎn)生明顯的影響。例如， 一個(gè) z=10℃的生物指示劑系統(tǒng)中，溫度降低 1℃，會使滅菌率減少大約 20%。這可采用以 下方法計(jì)算： L=10(120121 )/10 ℃ = = 因此， z 值 =10℃的生物指示劑系統(tǒng)，如以滅菌率來表示的話， 120℃下滅菌 1 分鐘相當(dāng) 于 121℃下滅菌 分鐘。 Fphysical值（ F 物理） 物理滅菌時(shí)間 10 F 值是一個(gè)滅 菌程序殺滅時(shí)間的量度。 F(Tref,z)是參照溫度 TRef 和溫度系數(shù) z 下以滅菌率 計(jì)算，被滅菌物品獲得的等效滅菌時(shí)間。由物理數(shù)據(jù)（時(shí)間和溫度）計(jì)算得到 F 值也可以 F 物理來表示。 F 值是整個(gè)滅菌程序中滅菌率的積分值。說得實(shí)際一點(diǎn)，這個(gè)積分值是通過對梯形模式 的數(shù)字累計(jì)而得： FTref=d(∑ L) [等式 3] 式中： d=每次溫度讀數(shù)之間的間隔時(shí)間 L=經(jīng)計(jì)算的各個(gè)溫度下的滅菌率 時(shí)間 溫度示例表闡述了分步計(jì)算滅菌率和殺滅時(shí)間 F 值的方法 。市售的數(shù)據(jù)采集設(shè)備 中有程序，可自動(dòng)完成計(jì)算并報(bào)告滅菌程序的 F 的增值和累計(jì)值。因用以確定滅菌率 L 的 z 本身準(zhǔn)確性不高，可規(guī)定積分開始和結(jié)束的最低溫度（例如 100℃） 。在滅菌階段，滅菌實(shí) 際溫度應(yīng)接近所用的參照溫度（ Tref） ，這點(diǎn)十分重要。