【導讀】濕熱滅菌程序的驗證：滅菌程序的設計、開發(fā)、確認以及日?？刂?

　　

【正文】 在半對數(shù)曲線上將結果以存活數(shù)對滅菌時間（等效暴熱時間）作圖，再根據曲線的斜率確定 DT。 DT 值即是最佳數(shù)據點所組成直線的負倒數(shù)。必要時，可通過線性回歸分析，來確定最佳曲線的斜率。 微生物殘存曲線示例 用圖 的數(shù)據，可得到以下生物指示劑（ BI）殘存曲線的等式： Lg NF = F(T,z)/DT＋ Lg N0 Lg NF = F/＋ Lg106 還可用此等式來計算滅菌 F 分鐘后，預計的孢子數(shù) NF 。如果滅菌時間的物理參數(shù)是 30 分 鐘， NF 為 106 ，也就是說，滅菌 30 分鐘后，孢子存活的概率為一百萬分之一，計算式如 下： Lg NF = F/+ Lg106 Lg NF = 30/+ Lg106 Lg NF = 12+6 Lg NF = 6 NF = 106 也可將此等式重排，根據滅菌后生物指示劑的測得的殘存數(shù)來計算滅菌時間 F（殺滅時間） F = （ Lg N0LgNF） DT F = （ Lg 106 Lg210 3 ） 分鐘 F = （ ） F = 分鐘 陰性分數(shù)法 陰性分數(shù)法采用 N0 及額定滅菌時間范圍中的一個點組成一條線，由此確定 DT 值。額定 滅菌時間范圍是指在滅菌的某個時間區(qū)域內，一組平行的試樣會呈現(xiàn)兩種結果的區(qū)域，即一 些為陽性結果，另一些為陰性結果。有兩個主要的方法可用以分析陰性分數(shù)法的數(shù)據，以確 定殘存曲線二點的 NF 值： y HolbSpearmanKarber 法。在此方法中，將額定滅菌時間范圍所有的數(shù)據通過 加權平均法合并起來，得到與每個生物指示劑 NF 平均存活數(shù)為 相對應的平均 時間（ 11， 12， 13） y StumboMurphyCochran 法 （ 14） 。 此法要用 HalvorsonZiegler 的最大可能數(shù)法 （ 15） 對額定滅菌時間區(qū)域中的每個數(shù)據逐個分析，來確定每一組數(shù)據的 NF，然后確定 DT 值。再對這些 DT 值求平均值，以確定測試的 DT 值。 HolbSpearmanKarber 法能夠計算 DT 值可信度的范圍， 供評估試驗數(shù)據的質量和可 靠性參考。 需要特別注意的是，應用統(tǒng)計學方法計算 DT 值時，需嚴格遵循統(tǒng)計分析的規(guī)則。試驗 中采用的生物指示劑應是平行試樣，且必須來自同一生物指示劑的批號。如果是企業(yè)自己制 備試樣，則試樣應該取自同一批生物指示劑的懸浮液，且制備方式完全相同。試驗中的培養(yǎng) 計數(shù)步驟應完全一致。唯一的變量只是蒸汽滅菌的時間。 此外，對每組某一滅菌時間平行試驗的樣品而言，試驗必須保證每個試樣的滅菌時間相 似。通常用耐 熱性測試儀在實驗室中完成此試驗。當樣品不是實際的平行試樣時，不宜采用 這類測試方法。例如，當生物指示劑分布在整個滅菌腔室時，不應當用這些方法來評價生產 用滅菌器中 BI 的殺滅情況。在此種情況下，因整個滅菌器中滅菌率的均一性難以保證，因 此，不能將這些生物指示劑試樣看成平行樣品。 在 DT 值測試中，保證每個滅菌試驗條件的一致性是至關重要的。一個正常運行的耐熱 性測試儀是實現(xiàn)一致性理想的機械裝置，因為它可以產生近似于脈沖的方形波，加熱和冷卻 時間極短（見圖 ） 。 在以下情況 下，通常有必要測試 DT 值： y 按產品特性設計滅菌程序需要確定產品分離菌的耐熱特性時 （產品分離菌通過熱休 克 8 獲得） ； y 評價處方變更對耐熱性的影響時； y 在常規(guī)生產中，需要確定從生產環(huán)境分離出耐熱菌的耐熱特性時； y 當需要確定作為生物指示劑用的直接接種到物料或產品中的耐熱孢子的 D 值時。 溫度系數(shù)（ z 值） 孢子耐熱性隨溫度變化而變化的特性可用 z 來表示。 z 值是 DT 值變更一個對數(shù)單位時， 溫度需調節(jié)的度數(shù)。它類似于半對數(shù)模式中的溫度系數(shù)。在比較不同 溫度下對孢子的滅菌率 時，需要用 z 來計算 F 值。 例如， 生物指示劑挑戰(zhàn)系統(tǒng)的 z=8℃， 即溫度每變化 8℃， DT 值將會改變一個對數(shù)單位。 如果生物指示劑挑戰(zhàn)系統(tǒng)的 D121℃為 分鐘， 那么 D129℃即為 分鐘， D113℃為 分鐘。 溫差的正確測量單位是開氏溫度， 在任何情況下， 開氏 （ Kelvin） 溫度變化 1℃與攝氏 （ Celsius） 溫度變化 1℃是完全一致的。為了簡化起見，本文將全文采用攝氏溫度。 濕熱滅菌通?？傇O定在一個小的溫度范圍以內，例如 110135℃之間，因此，在實際使 用中， 通常將經驗測試值 z 看作一個常量 （ 16） 。 常規(guī)滅菌程序設計和評估中 z 取 10℃或 18176。 F。 在對比平衡滅菌賦予產品的物理殺滅時間和生物殺滅時間 F 值的試驗中，必須使用實際的 生物指示劑的 z 值來計算物理殺滅時間 FT。 z 值可由幾種方法確定；然而，采用得最多的方法還是通過 D 值的測試來確定 z 值。在 不同溫度下測得一組 D 值，取對數(shù)，然后以 y 軸為 D， x 軸為溫度作圖。將數(shù)據點連成一 條直線。 z 值是 D 值改變一個對數(shù)單位所對應溫度變化 的度數(shù)，例如由 分鐘變?yōu)? 分 鐘，或者由 分鐘變?yōu)? 分鐘。與 D 值類似， z 值是此直線斜率的負倒數(shù)，參見耐熱性 曲線（圖 ） 。 （ 17）在應用 z 值時，要根據預期的用途，采用攝氏溫度（開氏）或華氏 溫度（ Fahrenheit）來表述，并考慮好溫度的數(shù)值范圍。 滅菌率（ Lethal Rate）和累計殺滅時間（ lethality， F） 9 在濕熱滅菌中，所有生物學的測量，無非是將參照溫度下（ Tref）的等效滅菌時間與該 溫度下對微生物的 殺滅時間相關聯(lián)。采用 z 來計算滅菌率，測試時間 溫度并將獲得的數(shù)據 累計，這樣也就獲得了滅菌工藝的模式。 各種滅菌器是設定在特定溫度下運行的，然而，實際溫度可能會在目標值上下一定的范 圍內波動。這個波動有時可能并不體現(xiàn)在滅菌程序的記錄上，它取決于記錄設備的精密度和 靈敏度。盡管這個波動通常不大，但對 F 值的可能會有明顯的影響，尤其是滅菌溫度大部 偏在目標值的一側時，影響更為明顯。 F 值的計算考慮了所有偏離目標溫度的波動情況，以 減少單個溫度觀察值對殺滅時間（ delivered lethality， 總等效滅菌時間）的影響。殺滅時間 是滅菌程序中滅菌率的累計值（積分值） 。 滅菌率（ L， Lethal Rate） 為了理解如何確定一個滅菌程序的殺滅時間（ F 值） ，有必要首先理解滅菌率（ L） 。滅 菌率可以通過以下等式計算得到： （ 18， 19， 20） L(Tref,z)=10(TTref)/z [等式 2] 式中： T = 被加熱的物體的實際溫度 Tref = 參照溫度 z = 試驗生物指示劑的 z 值（如未知，則取 10℃） 滅菌率是一個指數(shù)函數(shù)，因此，很小的溫度變化就會對滅菌率產生明顯的影響。例如， 一個 z=10℃的生物指示劑系統(tǒng)中，溫度降低 1℃，會使滅菌率減少大約 20%。這可采用以 下方法計算： L=10(120121 )/10 ℃ = = 因此， z 值 =10℃的生物指示劑系統(tǒng)，如以滅菌率來表示的話， 120℃下滅菌 1 分鐘相當 于 121℃下滅菌 分鐘。 Fphysical值（ F 物理） 物理滅菌時間 10 F 值是一個滅 菌程序殺滅時間的量度。 F(Tref,z)是參照溫度 TRef 和溫度系數(shù) z 下以滅菌率 計算，被滅菌物品獲得的等效滅菌時間。由物理數(shù)據（時間和溫度）計算得到 F 值也可以 F 物理來表示。 F 值是整個滅菌程序中滅菌率的積分值。說得實際一點，這個積分值是通過對梯形模式 的數(shù)字累計而得： FTref=d(∑ L) [等式 3] 式中： d=每次溫度讀數(shù)之間的間隔時間 L=經計算的各個溫度下的滅菌率 時間 溫度示例表闡述了分步計算滅菌率和殺滅時間 F 值的方法 。市售的數(shù)據采集設備 中有程序，可自動完成計算并報告滅菌程序的 F 的增值和累計值。因用以確定滅菌率 L 的 z 本身準確性不高，可規(guī)定積分開始和結束的最低溫度（例如 100℃） 。在滅菌階段，滅菌實 際溫度應接近所用的參照溫度（ Tref） ，這點十分重要。