基因工程在食品工業(yè)中的應用-資料下載頁
2025-01-16 15:14本頁面
【正文】 到載體DNA和外源 DNA片段自身兩端為非同源的黏端 ， 此時載體和外源 DNA片段都不會發(fā)生自身環(huán)化 ， 而且只有在 DNA連接酶的作用下 ， 載體 DNA和外源 DNA片段以兩端互補實現DNA定向插入 。 優(yōu)點 ： （ 1） 外源 DNA只能以一個方向插入到重組質粒 ， 以便目的基因的正確轉錄和表達 。 （ 2）由于不會自身環(huán)化，轉化率高，轉化后的細菌克隆大多數是攜帶有目的基因的重組質粒。 配伍末端 （ patible end） ：由兩種不同的限制酶切割的 DNA片段 、 具有相同類型的黏性末端 。 同尾酶 （ isocaudamers） :來源不同 ， 能夠對 DNA切割產生相同的黏性末端 ， 而其識別序列的特異性不同 。 同尾切割可以產生完全配伍 （ 互補 ） 的黏性末端 ，便于兩個 DNA片段的連接 。 同裂酶 （ isoschizomers） ：來源不同 ， 具有相同識別序列 ， 但切點不同 。 經過同裂酶切割過的 DNA與載體連接前可能還必須進行前處理 。 具有平末端的酶切載體只能與平末端的目的基因連接。在一定的反應條件下，可用 T4DNA連接酶將平齊末端的 DNA片段有效地連接起來。 人工接頭 ：人工合成的具有特定限制性內切酶識別和切割序列的雙股平端 DNA短序列，將其接在目的基因片段和載體 DNA上，使它們具有新的內切酶位點，應用相應的內切酶切割，就可以分別得到互補的黏性末端。 利用同聚物序列之間的退火作用完成連接。末端轉移酶在 DNA片段的 3’末端添加同聚尾造成延伸部分。末端轉移酶不具有特異性，在 4種 dNTP中任何一種均可作為前體物，可以產生由單一核苷酸所構成的 3’同聚物末端。 三、將重組體導入受體細胞（重組轉化體的獲得） 轉化 （ transformation）：將重組質粒導入受體細胞，使受體菌遺傳性狀發(fā)生改變的方法。 轉染 （ transfection） :將攜帶外源基因的病毒感染受體細胞的方法。 根據受體生物，一般可將重組體導入受體細胞的方法主要分為 大腸桿菌轉化法 、 酵母轉化法 、 植物細胞轉化法和 動物細胞轉化法 。 首先將對數生長期的大腸桿菌懸浮于冰預冷的低滲氯化鈣溶液中處理，使細胞膜通透性增加，然后加入重組 DNA，使 DNA與鈣離子形成復合物，吸附于細胞表面，經 42℃ 短暫的熱處理，促進外源 DNA進入宿主細胞。 首先將重組的 λ 噬菌體 DNA或柯斯質粒 DNA體外包裝成具有感染能力的 λ 噬菌體顆粒 ， 然后經由在受體細胞表面的 λ 噬菌體接受器位點使這些重組體 DNA注入大腸桿菌宿主細胞 。 四、重組轉化體的篩選和鑒定 （ 一 ） 利用表型特征進行篩選 （ 遺傳檢測法 ） 表型 ：指機體遺傳組成同環(huán)境相互作用所產生的外觀或其他特征。 （ 1） 抗藥性標記基因插入失活篩選法 （ 2） β －半乳糖苷酶顯色反應篩選法。 DNA提供的表型特征進行篩選 要求外源 DNA是一個完整的基因 ， 而且能夠在大腸桿菌或其他受體細胞中實現功能表達 。 以 λ 噬菌體載體與外源 DNA構建的重組體的篩選主要依賴于重組體的大小及形成噬菌斑的能力。 重組體 DNA只有在為野生型 λ 噬菌體 DNA的 75%～ 105%的長度時，才能在培養(yǎng)平板上形成清晰的噬菌斑，而載體 DNA自身不會包裝成活的噬菌體顆粒。 （ 二 ） 物理篩選鑒定法 根據 DNA分子質量的大小 ， 以凝膠電泳檢測重組體 。 R環(huán) ：指 RNA通過取代與其序列一致的 DNA單鏈而與另一單鏈 DNA雜交 ， 被取代的 DNA單鏈與 RNADNA雜交雙鏈所形成的環(huán)狀結構 。 R環(huán)結構一旦形成就十分穩(wěn)定。應用 R環(huán)檢測法可鑒定出雙鏈 DNA中存在的與特定 RNA分子同源的區(qū)域（可在電子顯微鏡下觀察）。 （ 三 ） 利用限制性內切核酸酶酶切進行鑒定 選擇適當的限制酶對重組體 DNA進行酶切鑒定 。 （ 四 ） 利用核酸雜交進行鑒定 采用的核酸雜交法是常用的幾種核酸雜交法 ， 例如Southern雜交 、 Northern雜交等 。 （ 五 ） 利用 PCR技術進行鑒定 利用 PCR技術可以對目的基因等特異核酸進行鑒定 。 （ 六 ） 利用免疫學方法進行篩選鑒定 基本原理：以目的基因在受體細胞中的表達產物（多肽）作抗原，以該基因產物的免疫血清作抗體，根據抗原－抗體反應，即可篩選鑒定出目的基因克隆及其產物。 （ 七 ） 利用 Western雜交進行鑒定 Western雜交 ：將蛋白質電泳 、 吸印 、 免疫測定融為一體的特異蛋白質的檢測方法 。 （ 八 ） 利用核苷酸序列測定進行鑒定 利用核苷酸序列測定技術可以對目的基因等特異核酸進行鑒定 。 （ 九 ） 轉譯篩選鑒定法 利用無細胞翻譯系統(tǒng)檢測經處理后的 mRNA的生物學功能 。 第三節(jié) 基因工程在食品工業(yè)中的應用 （一）改良微生物菌種 （麥芽糖透性酶和麥芽糖酶） （ α －淀粉酶、糖化酶） （ α －淀粉酶） 微生物菌種 例如，氨基酸、有機酸、維生素、增稠劑、乳化劑、表面活性劑、食用色素、食用香精及調味料等也可采用基因工程菌發(fā)酵生產而得到。 一、利用基因工程改造食品微生物 （ 二 ） 改良乳酸菌遺傳特性 （食品安全） （乳酸、乙醛、丁二酮、 3－羥基－ 2－丁酮、丙酮和丁酮等，黏多糖） （產生有機酸的酶系、合成多糖的酶系、降低膽固醇的酶系、分解脂肪的酶系） （ nisin、 diplocoxin、 lactocillin） （ 三 ） 酶制劑的生產 （四）利用基因工程改良食品原料的品質 （ 1）提高植物性食品氨基酸的含量 （ 2）增加食品的甜味 （ 五 ） 利用基因工程改進食品生產工藝 DNA重組技術改進果糖和乙醇生產方法 思考題 ， 主要有哪些活性 ？ ， 各有什么優(yōu)缺點 ？ （ PCR） 的基本原理 ？ PCR反應體系的組成 ？ ？ ？ 各有什么特點 ？ ？ ， 綜述一種基因工程在食品工業(yè)中的應用 。
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