【正文】 0bp；切割作用隨機 。 Ⅱ 型限制酶是基因工程理想的工具酶 。 限制性內切核酸酶沒有種屬特異性 ， 即限制性內切核酸酶識別 、 切割特定序列的能力同底物 DNA的來源無關 ，它可識別 、 切割各種來源的 DNA。 在識別序列雙鏈 DNA兩條鏈的對稱軸兩側同時從 3’端切斷磷酸二酯鍵，形成 3’羥基 端 2～ 5個核苷酸突出 單鏈黏性末端 。 dcm甲基化酶 ：催化 DNA分子中 5’CCAGG3’或 5’CCTGG3’序列中的 胞嘧啶 C5位置的甲基化。 TrisHCl的作用在于使反應液的pH值穩(wěn)定于酶活性所要求的最佳范圍內，而后三者均有穩(wěn)定酶的作用。 （ 1）在特異位點上切割 DNA，產生特異的限制酶切割的DNA片段。 基因工程中，將某種生物的全部基因組的遺傳信息，貯存在可以長期保存的穩(wěn)定的重組體中，以備需要時能夠隨時應用它分離所需要的目的基因，這種保存基因組遺傳信息的材料，稱為 基因文庫 （ gene library） （ 4）用限制酶切出相同的黏性末端，以便重組 DNA。 末端脫氧核苷酸轉移酶 （簡稱末端轉移酶） 不以 DNA或 RNA為模板，而只是將核苷酸加到已有 DNA分子的末端。 （ 4）催化 DNA合成的方向是 5’→3 ’ 。 DNA聚合酶 Ⅰ 大片段 （ Klenow片段 ） 一條分子質量為 76KDa的多肽鏈 ， 一般由大腸桿菌 DNA聚合酶 I全酶經枯草桿菌蛋白酶水解獲得 ， 也可通過克隆技術獲得 。 分子質量為 65KDa， 是一種非常耐熱的依賴于 DNA的 DNA聚合酶 。 （ 依賴于 RNA的 DNA聚合酶 ） 常用的逆轉錄酶有兩種 ：一種來自禽成髓細胞瘤病毒 （ AMV） ， 由兩條多肽鏈組成 ， 分子質量為 170KDa。 逆轉錄酶無 3’→5 ’外切核酸酶活性，即無校對功能，其催化的聚合反應容易出錯。②以 32P標記的一種 dNTP或一種 rNTP來標記 DNA片段的 3’端。 主要用于 ：①連接帶匹配黏性末端的 DNA分子。 具 磷酸酶活性 ， 催化去除 5’磷酸的反應 。 三、基因工程的載體 載體 （ vector）：攜帶外源基因進入受體細胞的運載工具。 （ 3） DNA序列中有適當的限制性內切酶位點，最好是單一酶切位點，并位于 DNA復制的非必需區(qū)內，可以在這些位點上插入外源 DNA，但不影響載體自身 DNA的復制。 按照介導的作用目的，可將基因工程載體主要分為 克隆載體 和 表達載體 。 （一）大腸桿菌載體 質粒 :指細菌等生物細胞內一類獨立于染色體外而能自我復制的遺傳物質 。 （ 2）質粒的分類 根據復制控制類型：一般可將大腸桿菌質粒分為 嚴緊型復制控制質粒 和 松弛型復制控制質粒 。 松弛型復制控制質粒 :復制與宿主染色體的復制不同步，其與 DNA聚合酶 Ⅰ 的活性有關，而與蛋白質的合成無關。 ② 能插入 、 運載一定大小的外源基因 。 ⑥ 容易控制 ， 安全可靠 。 ③較高的拷貝數。 優(yōu)點 ①更小的分子質量和更高的拷貝數。 大多數噬菌體顆粒由呈 20面體的頭部及尾部構成 ， 例如 ， λ 噬菌體；還有一些噬菌體顆粒為線狀體形 ， 例如 ， M13。 （ 2） λ 噬菌體載體 λ 噬菌體顆粒由頭與尾兩部分組成。當λ 噬菌體感染宿主細胞時， λDNA 被注入宿主細胞后會迅速通過黏性末端的互補作用形成 環(huán)狀雙鏈 DNA分子 。 λ 噬菌體的必要基因： λDNA 至少包括 61個基因 。 λ 噬菌體載體的分類 ：根據插入方式 ， 一般可將 λ噬菌體載體分為 插入型載體 和 置換型載體 。廣泛應用于 cDNA以及小片段 DNA的克隆。 （ Cosmid vector） 也稱黏粒載體 ， 指一類由人工構建的含有抗性基因 、單一克隆位點 、 λDNA 的 cos位點 和質粒 復制子 的特殊類型的質粒載體 。帶有抗生素抗性基因，有些還帶有基因插入失活的克隆位點，為重組體的篩選提供了簡便的標記。 （ 一 ） 基本原理 在模板 DNA、 引物和 4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下 ，利用 DNA聚合酶催化合成反應 ， 體外擴增特異 DNA片段 。在第一輪擴增完畢后，將反應混合物再加熱使新構成的雙鏈 DNA變性，然后再度溫育使模板鏈與引物復性，進入第二輪特異性合成。 （ 2）復性（退火， annealling）。每個循環(huán)的擴增產物作為下一循環(huán)的模板。 最初采用 DNA聚合酶 Ⅰ 的 Klenow片段或 T4 DNA聚合酶催化 。 （ 4） 四種三磷酸脫氧核苷 （ 即 dNTP） ， 是合成 DNA所需的原料 。一共進行 30輪左右的循環(huán)。 一般又可將基因生物制備法分為 基因組文庫法 、 cDNA文庫法 和 PCR法 等 。 （ 二 ） 基因組文庫法 是一種直接從基因組中分離目的基因的方法。 二、目的基因與載體的重組（重組體的構建） 基因重組 （ gene rebination） ：利用限制性內切酶和其他一些酶類 ， 切割和修飾載體 DNA和目的基因 ， 并將兩者連接起來 。 優(yōu)點 ： （ 1） 外源 DNA只能以一個方向插入到重組質粒 ， 以便目的基因的正確轉錄和表達 。 同尾切割可以產生完全配伍 （ 互補 ） 的黏性末端 ，便于兩個 DNA片段的連接 。在一定的反應條件下，可用 T4DNA連接酶將平齊末端的 DNA片段有效地連接起來。末端轉移酶不具有特異性，在 4種 dNTP中任何一種均可作為前體物，可以產生由單一核苷酸所構成的 3’同聚物末端。 首先將對數生長期的大腸桿菌懸浮于冰預冷的低滲氯化鈣溶液中處理，使細胞膜通透性增加，然后加入重組 DNA，使 DNA與鈣離子形成復合物，吸附于細胞表面，經 42℃ 短暫的熱處理，促進外源 DNA進入宿主細胞。 DNA提供的表型特征進行篩選 要求外源 DNA是一個完整的基因 ， 而且能夠在大腸桿菌或其他受體細胞中實現功能表達 。 R環(huán) ：指 RNA通過取代與其序列一致的 DNA單鏈而與另一單鏈 DNA雜交 ， 被取代的 DNA單鏈與 RNADNA雜交雙鏈所形成的環(huán)狀結構 。 （ 四 ） 利用核酸雜交進行鑒定 采用的核酸雜交法是常用的幾種核酸雜交法 ， 例如Southern雜交 、 Northern雜交等 。 （ 八 ） 利用核苷酸序列測定進行鑒定 利用核苷酸序列測定技術可以對目的基因等特異核酸進行鑒定 。