酶譜法檢測血清基質(zhì)金屬蛋白酶mmp-mmp-9的活性-資料下載頁
2025-01-06 09:42本頁面
【正文】 基本過程是先將樣品進行 SDS聚丙烯酰胺（ SDSPAGE，含 ％明膠）電泳分離，然后在有二價金屬離子存在的緩沖系統(tǒng)中使樣品中的 MMP2和 MMP9恢復(fù)活性，在各自的遷移位置水解凝膠里的明膠，最后用考馬斯亮藍將凝膠染色，再脫色，在藍色背景下可出現(xiàn)白色條帶，條帶的強弱與 MMP2和 MMP9活性成正比。 實驗原理 實驗操作 ? 樣品制備 : 血清、血漿和尿樣品可取適量直接與 2 SDS 樣品緩沖液等體積混勻進行下一步實驗，如酶活性太高造成顯帶不理想，可適當(dāng)進行稀釋 。 ? 凝膠的制備 : 玻璃板對齊后放入夾中垂直卡緊。按表格配 10％分離膠，加入 TEMED后立即搖勻即可灌膠，灌膠時，可用 5ml加樣槍吸取凝膠沿玻璃板加進去，然后膠上加一層異丙醇，以隔離空氣中的氧，促進凝膠聚合（灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時凝膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡）。約幾分鐘后當(dāng)異丙醇和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了，再等 3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。按前面表格配 4％的濃縮膠，加入 TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠，然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時要使梳子保持水平。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出 。 ? 在每個加樣孔中加入 10 181。l 樣品 。 ? 電泳： 在 4℃ 100V下，約 2h。 ? 凝膠的處理： （ 1）電泳結(jié)束后，取下凝膠，放入平皿中，用洗滌緩沖液在室溫搖動下洗滌 1h，其間換液一次； （ 2）棄去洗滌緩沖液，然后加入孵育緩沖液沒過膠面，至 37℃ 恒溫箱中， 24h后取出； （ 3）棄去孵育緩沖液，加入 %考馬斯亮藍染液染色約 30min，回收染液，加入脫色液脫色至藍色背景和白色條帶均十分明顯時，用 5％乙酸中止脫色； （ 4）待凝膠在 5％乙酸中恢復(fù)到適當(dāng)大小后，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析結(jié)果，以白色條帶的凈光密度值相對定量樣品中酶活性。 預(yù)期實驗結(jié)果 N N P P 135kD 92kD 72kD NGAL/MMP9 ProMMP2 MMP9 第三部分，食管癌患者血液中 MMP2和 MMP9 的活性變化及其臨床意義 ? 癌癥的發(fā)生發(fā)展是多基因多因素參與的慢性長期過程。 ? 癌組織的發(fā)生發(fā)展有著由單純增生 → 不典型增生 → 原位癌 → 浸潤癌演變過程的連續(xù)性。 ? 癌癥分期大別分為四期： 第一期：腫瘤局限一處，沒有擴散跡象； 第二期：腫瘤已擴散到鄰近的淋巴結(jié)，但沒有波及其它器官或組織； 第三期：腫瘤除了擴散到鄰近淋巴結(jié)外，還波及附近器官或組織； 第四期：腫瘤已擴散到遠處的部位； 一般言之，第一、二期屬早期，治療后痊愈機會高；第三、四期屬晚期，治愈及存 活的機會較差。 實驗設(shè)計 1. 查閱相關(guān)資料，討論 MMP2與 MMP9在食管癌各發(fā)展階段的活性檢測能否作為監(jiān)控癌癥發(fā)展的一個指標，應(yīng)該注意什么問題，其臨床意義如何？ 2. 若發(fā)現(xiàn) MMP2與 MMP9在癌癥病人中出現(xiàn)異常，談?wù)勀憧赡懿扇〉姆椒▉矶粢诌@種情況。
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